空肠弯曲菌感染人和鸡体内表达抗原的筛选及其生物学特性初步鉴定

摘要

空肠弯曲菌是全球性分布的主要细菌性肠道病原菌，也是一种重要的食源性病原菌。近年来，空肠弯曲菌引发的人类感染病例在全球范围内逐年增加，尤其在发达国家，该菌对人类的威胁超过了沙门菌和志贺菌而跃居首位。 空肠弯曲菌可以定植于多种动物的肠道内，包括鸡、牛、羊、犬和野鸟，定植于人的大肠中可导致自限性腹泻。世界范围内空肠弯曲菌引发的人感染病例多呈散发。由于该菌在鸡群中广泛分布，禽肉及其制品是人类消费的主要肉食品之一，污染的禽肉成为人类弯曲菌病的主要来源，这给控制人感染弯曲菌的工作带来巨大的压力。疫苗是防控动物传染病的有效手段之一，但目前对防控空肠弯曲菌感染却没有十分理想的商品化疫苗可用。寻找控制该菌的关键性保护抗原，深入了解弯曲菌的生物学特性，尤其是对其致病机制的解析，将为防控空肠弯曲菌对人的威胁提供重要的理论依据。 由于没有合适的动物模型可用来研究空肠弯曲菌感染人的相关机制，因此很多学者尝试用分子生物学方法并结合细胞模型等手段来探讨其毒力特性。体内诱导表达抗原技术（in vivo-induced antigen technology, IVIAT）是一项新型的病原菌毒力基因筛选策略，因其不需要动物模型而备受关注。将IVIAT用于空肠弯曲菌的研究在国内外尚属空白。本文用IVIAT筛选了人和鸡被空肠弯曲菌感染后体内表达抗原，并用荧光定量PCR技术验证其体内表达特性。在此基础上借鉴IVIAT的原理，设计并建立了一种新型的免疫蛋白组学技术，同时解析了空肠弯曲菌在人体内感染时表达的抗原，取得了满意的结果。 1.人源和鸡源空肠弯曲菌分离株主要毒力基因的分布分析 空肠弯曲菌基因组序列中含有高变量序列，且在不同菌株的毒力基因之间变异较大。本研究选取39株人源空肠弯曲菌分离株，31株鸡源分离株进行主要毒力基因分布调查。首先选择与细菌黏附、定植、入侵、外毒素和脂多糖合成等相关的27个毒力基因为检测靶基因，然后参考已公布的空肠弯曲菌NCTC11168标准株全基因组序列，分别设计特异性PCR引物，最后分别对人源株和鸡源株进行PCR检测。结果显示:鸡源空肠弯曲菌分离株中，黏附相关基因peb1A和cadF的阳性率较高，分别为100％和97％;定植因子中阳性率最高的是cheY，鸡分离株为100％，人分离株为92％;入侵相关基因中，鸡源株的分布阳性率均小于90％，最小的为virB11(9.7％);人源株的阳性率最高为92％（iamA），最低的virB11仅为5％;外毒素相关基因cdtA、cdtB和cdtC在人源株与鸡源株间并无明显差异，均以cdtB为最高，分别是97％和94％;脂多糖合成相关基因wlaN、waaF、neuB11检出率在人源和鸡源空肠弯曲菌的分离株中均不高。人源和鸡源空肠弯曲菌分离株中毒力基因的分布总体没有明显差异，但不同功能基因略有不同，人源株中入侵和脂多糖合成相关的基因分布较高。本部分对空肠弯曲菌已知毒力基因在人和鸡源分离株中的分布分析，有助于为体内毒力基因的筛选提供参考。 2.空肠弯曲菌全基因组表达文库的构建及鉴定 空肠弯曲菌是一种重要的人兽共患病原菌，鸡是其主要的贮存宿主，人感染后多表现为自限性胃肠炎。本研究旨在构建空肠弯曲菌NCTC11168株的基因组表达文库，为研究空肠弯曲菌体内表达抗原及其致病机制奠定基础。首先将该菌的基因组DNA用Sau3AⅠ部分酶切后，切胶回收大小400～3000bp的片段。然后用BamHⅠ酶切原核表达pET30a(b，c)系列载体，用SAP去磷酸化后，切胶回收线性质粒载体。接着将回收的基因组DNA片段与线性载体按10∶1摩尔比例连接，转化DH5α感受态细胞，用载体特异性引物分析插入片段大小分布和插入正确率。然后从转化的平板上刮菌提取重组质粒，转化表达宿主菌BL21(DE3)的感受态细胞，获得该菌的原核表达文库。用IPTG诱导转入文库质粒的BL21(DE3)大肠杆菌，SDS-PAGE鉴定被诱导蛋白的表达情况。最后确定该菌基因组表达文库构建的关键参数:用常规方法提取基因组，以0.5 U/μgSau3AⅠ在37℃部分酶切基因组30 min，片段集中于400～3000 bp。载体用2.5U/μg BamHⅠ线性化，后用0.8U/μg SAP将其完全去磷酸化。按基因组片段与载体摩尔数10∶1连接转化DH5α感受态细胞，获得了基因组表达文库。结果显示:库容量达52700个克隆，其可以覆盖空肠弯曲菌NCTC11168株的全基因组4次以上，片段插入正确率为83.3％～91.7％，片段大小介于400～3000 bp，且均匀分布，IPTG诱导体外表达文库后蛋白呈现正确表达。本研究成功构建了空肠弯曲菌的基因组表达文库，为研究空肠弯曲菌的致病机制等提供了重要的平台。 3.基于IVIAT技术筛选空肠弯曲菌感染在鸡和人体内表达抗原 弯曲菌对人和鸡的感染具有不同的机制:一般情况下鸡带菌但并不发病，而人却表现明显的临床特征。细菌感染宿主时体内瞬时表达的基因与病原菌的致病性密切相关，某些可能是关键性的毒力基因。本研究采用IVIAT筛选空肠弯曲菌感染或定植人和鸡时该菌在宿主体内表达的抗原。在构建空肠弯曲菌NCTC11168全基因组表达文库的基础上，用体外条件培养的空肠弯曲菌菌体或体外诱导表达抗原，分别对病人康复期的血清和人工感染鸡的高免血清作反复吸附处理，彻底除去血清中能识别体外表达抗原的抗体，仅保留可以识别体内诱导表达抗原的抗体组份。然后，用吸附后的人和鸡血清分别对体外诱导的基因组表达文库的抗原进行免疫识别。经过初筛和2次复筛共得到了86个阳性克隆，将其送生物公司作双向DNA测序分析，去掉其中移码表达和重复出现的克隆，最后确定了48个体内表达抗原的编码基因，其中鸡源有27个，人源21个。这些蛋白主要涉及细菌代谢(31.3％)、大分子生物合成(12.5％)、遗传信息加工(18.8％)、转导(8.3％)、调控(12.5％)及其他生物过程(8.3％)，另外还有3个功能未知的蛋白(Cj0092、Cj0788、CJE1639)。用人和鸡的吸附血清还筛选到了6个共有蛋白(fabH、hemL、leuC、aspS、Cj1200、Cj8486_0361)，它们可能是该菌感染人和鸡时在体内表达的共同抗原。另外我们还筛选到已经被证实的几种体内表达的毒力相关基因，如chuA，flgS，cheA，flhF，rplA，Cj0190c，Cj0100和Cj0788。本研究首次用IVIAT方法研究了空肠弯曲菌感染人和鸡不同宿主的抗原表达谱，为解析该菌的致病机制奠定了重要基础。 4.实时荧光定量PCR检测空肠弯曲菌感染相关因子的体内外表达差异 空肠弯曲菌在0.1％的去氧胆酸盐（sodium deoxycholate，DOC）培养基中生长可以模拟体内感染条件，本研究比较了在CCDA培养基和添加DOC的条件下培养后空肠弯曲菌体内表达因子的表达差异，以验证IVIAT筛选的基因在宿主体内的表达。实验采用SYBR(R)Green实时定量PCR(qRT-PCR)法的相对定量分析(2-△△CT)比较目的基因在体内外转录水平的差异。根据IVIAT筛选得到的48个编码序列，按其类别随机选取10个基因(rplA、Cj0100、Cj0788、cheA、Cj0006、fabH、hslV、Cj1200、aspS和flhF)进行试验。在CCDA和DOC培养基上分别增殖15h后，刮取菌苔提取空肠弯曲菌的总RNA，反转录为cDNA后进行定量PCR分析。结果显示:5个基因（Cj0100、Cj0788、Cj0284c、Cj0663和Cj1200）可以在模拟体内感染的DOC培养环境中上调表达，而其余5个基因上调表达不显著。证明IVIAT筛选所得基因为细菌体内感染过程中表达的基因，与致病作用相关。 5.体内表达抗原免疫蛋白组学新技术的建立及其初步应用 目前，尚未出现有效的控制人空肠弯曲菌病和鸡体内带菌的疫苗。细菌感染宿主时在体内被诱导表达的抗原可能是重要的保护性亚单位疫苗候选位点和毒力标记。本研究建立了一种筛选体内表达抗原的免疫蛋白组学新方法，用体外表达抗原预先吸附的血清筛选空肠弯曲菌NCTC11168感染人过程中的体内诱导表达抗原分子。共筛选出14个免疫反应性蛋白点，将其从胶中挖点经MALDI-TOF MS测序，PMF及BLAST分析后，最终确定了14个体内诱导表达的抗原，包括CadF、CheW、TufB、DnaK、MetK、lpxB、HslU、DmsA、PorA、ProS等。然后用实时荧光定量PCR分析其中的9个编码基因在体内体外不同环境的表达差异，结果表明8个基因呈现体内上调表达。本研究建立的方法为筛选病原菌感染宿主后体内表达相关抗原提供了新途径，该法不仅能高通量特异筛选体内表达抗原，而且节省大量人力和时间。

目录

摘要

符号说明

综述 空肠弯曲菌致病机制研究进展

1 病原特征

2 流行病学特征

3 基因组特征

4 鞭毛特征

5 荚膜特性

6 黏附与入侵

7 毒素特性

8 空肠弯曲菌感染人的分子特征

9 空肠弯曲菌感染鸡的分子特征

10 空肠弯曲菌致病机制研究新技术

11 体内诱导抗原技术

12 结语

第一章 人源和鸡源空肠弯曲菌分离株主要毒力基因的分布分析

1 材料与方法

1．1 材料

1．2 细菌DNA模板的制备

1．3 毒力基因引物设计与合成

1．4 PCR扩增及分析

2 结果

2．1 毒力基因PCR扩增结果

2．2 鸡源和人源菌株中27种毒力基因分布分析

3 讨论

第二章 空肠弯曲菌全基因组表达文库的构建及鉴定

1 材料与方法

1．1 菌株与载体

1．2 主要试剂

1．3 主要仪器设备

1．4 空肠弯曲菌基因组DNA提取

1．5 软件模拟酶切

1．6 空肠弯曲菌基因组DNA部分酶切

1．7 基因组DNA酶切片段的回收

1．8 表达载体pET30a(b，c)的酶切和去磷酸化处理

1．9 基因组片段与载体连接转化

1．10 表达文库的PCR鉴定

1．11 文库诱导表达及鉴定

2 结果

2．1 空肠弯曲菌基因组的纯度

2．2 软件模拟酶切

2．3 基因组DNA部分酶切

2．4 表达载体的酶切和去磷酸化处理

2．5 基因组表达文库的构建与鉴定

2．6 基因组表达文库插入率分析

2．7 基因组表达文库蛋白表达分析

3 讨论

第三章 基于IVIAT技术筛选空肠弯曲菌感染在鸡和人的体内感染相关抗原

1 材料与方法

1．1 菌株、血清样品和实验动物

1．2 主要试剂

1．3 主要仪器

1．4 血清

1．5 血清的吸附

1．6 斑点免疫印迹筛选

1．7 人和鸡特有体内表达基因的分析

1．8 Western-blotting验证体内基因的表达及反应特异性

1．9 flhF基因的重组表达与分析

1．10 分析不同源分离株中IVI-基因的分布

2 结果

2．1 血清制备

2．2 血清吸附效果

2．3 Dot-ELISA评价血清吸附效果

2．4 免疫筛选与鉴定

2．5 序列分析

2．6 人和鸡特有体内表达基因的分析

2．7 Westem-blowing验证体内基因的表达及反应特异性结果

2．8 鸡flhF基因的重组表达与分析

2．9 鸡源及人源空肠弯曲菌分离株中IVI-基因的分布

3 讨论

第四章 实时荧光定量PCR检测空肠弯曲菌感染相关因子的体内外表达差异

1 材料与方法

1．1 细菌

1．2 主要试剂

1．3 主要仪器设备

1．4 细菌总RNA的提取

1．5 NCTC 11168基因组的提取

1．6 反转录合成cDNA

1．7 荧光定量PCR

2 结果

2．1 PCR验证引物

2．2 融解曲线

2．3 扩增曲线

2．4 荧光定量PCR检测体内感染相关因子的表达情况

3 讨论

第五章 体内表达抗原免疫蛋白组学新技术的建立及其初步应用

1 材料与方法

1．1 细菌和血清

1．2 主要试剂

1．3 筛选方案设计

1．4 主要仪器设备

1．5 试剂配制

1．6 吸附血清的制备

1．7 全菌蛋白制备

1．8 二维电泳

1．9 胶的固定及染色

1．10 二维蛋白blotting操作

1．11 图像比对及蛋白点采集

1．12 数据库检索

1．13 Real-Time RT-PCR验证筛选的体内表达抗原

1．14 抗原性分析

2 结果

2．1 血清吸附

2．2 二维电泳

2．3 2D-blotting

2．4 生物信息学分析

2．5 荧光定量PCR分析体内相关基因的表达

2．6 抗原性分析

3 讨论

参考文献

全文总结

致谢

攻读学位期间发表的学术论文与学术交流

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