山羊瘤胃原虫与细菌之间氮周转规律与机制的研究

摘要

目前反刍动物氮利用效率偏低(G.Lobely，J.MacRea)，其原因可能是:饲料氮源随动物粪尿的排出;日粮优质蛋白的降解;微生物蛋白在瘤胃内的再循环。在瘤胃微生态系统中，原虫的吞噬行为、自溶现象以及高的脱氨基活性都可能加剧瘤胃内氮素的无效循环，降低氮的利用效率。 为此，本课题从动态角度，结合微生态瘤胃内环境、微生物氮周转、微生物活性、微生物区系变化及主要微生物相对数量的变化，系统地探讨瘤胃原虫与细菌之间氮周转的规律及其机制。在生产中可采用有效的营养调控措施，提高反刍动物对氮的利用效率。 第一章瘤胃原虫与细菌之间氮周转研究方法的建立 本试验旨在探讨荧光光度法研究瘤胃原虫对细菌吞噬作用的可行性。试验选用4只装有永久性瘤胃瘘管的徐淮山羊采集瘤胃液以获取瘤胃原虫和细菌，以4'，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)标记细菌的荧光强度为主要测定指标，研究山羊瘤胃中原虫对细菌的吞噬作用。结果表明，DAPI标记的瘤胃细菌浓度与其荧光强度之间存在线性相关(R2=0.9952)。在日粮粗精比为7∶3的条件下，徐淮山羊瘤胃原虫对细菌的吞噬速率为370.89 cells/(cell·h)，瘤胃内原虫对细菌的吞噬速率存在一定的波动性，吞噬量在60 min达到饱和，其最大吞噬量为370.89 cells/cell。结果提示，荧光光度法可应用于瘤胃原虫对细菌吞噬作用的研究。 第二章不同日粮精粗比对瘤胃原虫与细菌之间氮周转的影响 本研究以四只安装永久性瘤胃瘘管的徐淮山羊为试验动物，设置精（玉米-豆粕）:粗（稻草）分别为0∶100、30∶70、50∶50、70∶30、100∶0的五种比例日粮(A、B、C、D、E)，采用DAPI荧光标记技术及动态示踪技术，在体外培养条件下研究不同精粗比对微生物氮素周转的影响。结果表明，随精粗比变化，原虫氮、细菌氮及原虫与细菌之间氮的周转速率的变化规律基本一致。即随精粗比的增加先上升后下降，原虫氮周转速率C组最高为9.067μg/mL h;细菌氮周转速率D组最高为5.122μg/mL h;原虫与细菌之间的氮周转速率各组分别为2.09、2.29、1.60、1.95、1.25 pg N/(cell h);因原虫对细菌的吞噬造成的细菌氮素损失量分别为:A组339.17 mgN/（只d）、B组428.72 mgN/（只d）、C组393.84mgN/（只d）、D组424.10mgN/（只d）、E组165.33 mgN/（只d）。微生物总氮周转速率均值随精粗比的增加呈现波动，其中B组最高为11.867μg/mL h。各组微生物总氮周转速率与原虫氮周转速率之间存在极显著正相关。回归分析表明，微生物氮周转速率与精粗比值呈三次方曲线关系: Y1=0.007+0.016X-0.036X2+0.019X3，R2=0.929;Y2=0.002+0.005X+0.003X2-0.005X3,R2=0.965; Y3=0.008+0.034X-0.090X2+0.058X3,R2=0.984（Y1、Y2、Y3分别为原虫氮、细菌氮及微生物总氮周转速率）。瘤胃内环境总氮的周转速率各组均与瘤胃内环境中氨基酸态氮呈现显著或极显著正相关，B组相关性最高（相关系数，r=0.960）。微生物的遗传指纹图谱表明细菌和原虫内部菌群结构因不同精粗比而发生了相应的变化。瘤胃蛋白质降解菌（嗜淀粉瘤胃杆菌（R.amylophilus）、溶纤维丁酸弧菌(B.fibrisolvens)和栖瘤胃普雷沃氏菌(P.ruminicola)）在不同的精粗比处理下生长有所差异。 第三章不同碳源结构NSC/SC对瘤胃原虫与细菌之间氮周转的影响 本试验以酪蛋白为氮源，设置NSC/SC五种比例的纯合日粮(A、B、C、D、E)分别为:0.5、1.0、1.5、2.0、2.5，在体外培养条件下研究不同碳源结构对微生物氮素周转的影响。结果表明:原虫氮的周转速率平均值各组分别为:12.883、17.882、17.860、14.602、17.797μg/mL h，A组最低。细菌氮的周转速率各组分别为:6.172、7.539、3.977、6.578、4.990μg/mL h，B组最高，C组最低。微生物总氮的周转速率随NSC/SC的增加逐渐升高。原虫和细菌之间的氮周转速率分别为0.73、0.73、1.79、1.94、1.62 pgN/(cellh)，因原虫对细菌的吞噬造成的细菌氮素损失量分别为:64.95、57.89、204.83、501.90和319.56 mgN/（只d），均以D组(NSC/SC=2)最高。各组微生物氮周转速率与原虫氮周转速率之间存在极显著正相关。各组微生物氮周转速率与细菌氮周转速率之间存在正相关，但均未达到显著水平(P＞0.05)。各组瘤胃内环境总氮的周转速率与氨氮的周转速率之间存在显著或极显著正相关。此外，A、E组瘤胃内环境总氮的周转速率与氨基酸态氮的周转速度之间存在显著正相关（r分别为0.848和0.823）。回归分析表明，原虫氮、微生物总氮周转速率与NSC/SC比值呈三次方曲线关系:Y1=0.011+0.022X-0.019X2+0.004X3，R2=0.715;Y2=0.016-0.01X+0.008X2-0.002X3，R2=0.994（Y1、Y2分别为原虫氮及微生物总氮周转速率）。原虫胞内、外肽酶和蛋白酶活性B组最高，与该组原虫氮的周转速率最高相一致。原虫/细菌密度随NSC/SC的增加而上升。微生物的遗传指纹图谱表明细菌和原虫内部菌群结构因不同NSC/SC而发生了相应的变化。NSC/SC对瘤胃蛋白质降解菌嗜淀粉瘤胃杆菌（R.amylophilus）、溶纤维丁酸弧菌(B.fibrisolvens)和栖瘤胃普雷沃氏菌(P.ruminicola)）的促生长作用有所差异。 第四章不同分子结构氮源对瘤胃原虫与细菌之间氮周转的影响 本研究设置四种纯合氮源日粮(A、B、C、D)分别为:无机态氮（NH4Cl）;肽氮(Pro-Arg-Met);氨基酸态氮（Pro，Arg，Met等比例混合物）;混合态氮（前三组等比例混合物），在体外培养条件下，研究不同分子结构氮源对微生物氮素周转的影响。结果表明:原虫氮的周转速率及微生物总氮的周转速率均为D组最高，B组最低。细菌氮的周转速率A组最高，D组最低。原虫和细菌之间的氮周转速率各组分别为1.48、2.09、1.17、1.87 pg N/(cell h)，原虫对细菌氮的存留量以D组最高。C组所需的周转时间最长为56.79 h。原虫对细菌的吞噬造成细菌氮素损失量分别为:A组343.4 mgN/(只d)、B组502.12 mgN/（只d）、C组263.75 mgN/（只d）、D组464.58 mgN/（只d）。各组微生物氮周转速率与原虫氮周转速率之间存在正相关，A、B、C组达显著水平。各组微生物氮周转速率与细菌氮周转速率之间C、D组为负相关，其它各组为正相关，但各组的相关性均未达到显著水平。瘤胃内环境总氮的周转速率A组与氨氮、氨基酸态氮的周转速度之间存在极显著正相关（r分别为0.866和0.885）;B组与瘤胃内环境中各不同形式氮的周转速度之间相关性均未达到显著水平;C组与氨基酸态氮周转速度之间存在极显著正相关(r=0.856);D组与氨态氮、可溶性蛋白氮及氨基酸态氮的周转速度之间存在极显著正相关（r分别为0.838、0.915和0.867）。原虫胞内肽酶和蛋白酶活性D组最高，与该组原虫氮的周转速率最高相一致。淀粉酶、木聚糖酶及滤纸纤维素酶的活性均以A组最高，与该组细菌氮的周转速率最高相一致。微生物的遗传指纹图谱表明细菌和原虫内部菌群结构因不同处理发生了相应的变化。不同分子结构氮源对嗜淀粉瘤胃杆菌（R.amylophilus）、溶纤维丁酸弧菌(B.fibrisolvens)和栖瘤胃普雷沃氏菌(P.ruminicola)）的促生长作用有所差异。 第五章不同单体氨基酸对瘤胃原虫与细菌之间氮周转的影响 本研究以四只安装永久性瘤胃瘘管的徐淮山羊为试验动物，设置五种氨基酸日粮(A、B、C、D、E)分别为:Pro、Arg、Met、Leu、Phe，研究不同单体氨基酸态氮对微生物氮素周转的影响。结果表明:原虫氮的周转速率平均值各组分别为:3.304、4.017、2.890、4.431、5.024μg/mL h，E组最高，C组最低。细菌氮的周转速率E组最高，C组最低。微生物总氮的周转速率B组最高，C组最低。原虫与细菌间氮的净周转速率各组分别为:2.33、2.53、1.79、1.61、0.72(pg N/cell h)。因原虫对细菌的吞噬造成的细菌氮素损失量分别为:A组518.88 mgN/（只d）、B组731.74 mgN/（只d）、C组336.72 mgN/（只d）、D组187.68 mgN/（只d）、E组60.71 mgN/（只d），各组氮损失量排序为:B＞A＞C＞D＞E。各组微生物氮周转速率与原虫氮周转速率之间存在正相关，A、B、C、D组达显著水平。瘤胃内环境总氮的周转速率A组与氨氮、尿素氮的周转速度之间存在极显著正相关;B组与氨氮的周转速率之间存在极显著正相关(r=0.842);C组与氨氮和可溶性氮的周转速度之间存在显著正相关;D组、E组与可溶性氮的周转速度之间存在显著或极显著正相关(相关系数分别为0.776和0.896)。原虫胞内蛋白酶活性E组最高，与该组原虫氮的周转速率最高相一致。淀粉酶活性、滤纸纤维素酶活性各组间差异不显著，果胶酶活性、木聚糖酶活性均表现为B组(Met)最高。微生物的遗传指纹图谱表明细菌和原虫内部菌群结构因不同单体氨基酸发生了相应的变化。不同单体氨基酸对瘤胃蛋白质降解菌（嗜淀粉瘤胃杆菌（R.amylophilus）、溶纤维丁酸弧菌(B.fibrisolvens)和栖瘤胃普雷沃氏菌(P.ruminicola)）的促生长作用有所差异。 第六章不同原虫控制剂对瘤胃微生物氮周转作用的影响 本研究以四只安装永久性瘤胃瘘管的徐淮山羊为试验动物，设置四种日粮(A、B、C、D)，其中A、B、C组添加原虫控制剂，分别为:银杏叶提取物(ginaton);丝兰皂甙（yuccaschidigera）;茶皂素(saponin);D组为对照组，研究原虫在瘤胃微生物氮周转中的作用。结果表明:原虫氮的周转速率平均值各组分别为:5.578、8.178、12.489、9.078μg/mL h，C组最高。细菌氮的周转速率及原虫和细菌之间的氮周转速率试验组均低于对照组。因原虫对细菌的吞噬造成的细菌氮素损失量分别为:A组529.71 mgN/（只d）、B组673.13 mgN/（只d）、C组521.08 mgN/（只d）、D组908.09 mgN/（只d），试验组均低于对照组。微生物总氮的周转速率平均值各组分别为:6.089、9.000、13.144、7.744μg/mL h，C组最高。各组微生物氮周转速率与原虫氮周转速率之间存在显著或极显著正相关。各组微生物氮周转速率与细菌氮周转速率之间A组为负相关，其它各组为正相关，但各组的相关性均未达到显著水平(P＞0.05)。各组瘤胃内环境总氮的周转速率均与氨基酸态氮的周转速度之间存在正相关，A、B、D三组达显著水平（相关系数分别为:0.831、0.842、0.909）; C组达极显著水平(r=0.986)。原虫与细菌密度比为D组最高，微生物的遗传指纹图谱表明细菌和原虫内部菌群结构因不同处理发生了相应的变化。原虫控制剂对嗜淀粉瘤胃杆菌(R.amylophilus)、溶纤维丁酸弧菌(B.fibrisolvens)和栖瘤胃普雷沃氏菌(P.ruminicola)）的促生长作用有所差异。

目录

论文说明

摘要

符号说明

第一篇 文献综述

第一章 反刍动物瘤胃微生物对含氮物质的代谢研究

1．反刍动物瘤胃内氮源物质的转化

2．瘤胃微生物对含氮物质的利用研究

3 影响瘤胃微生物降解蛋白质的因素

4．瘤胃微生物蛋白质的合成代谢及其影响因素

第二章 瘤胃原虫与细菌之间氮周转的研究进展

1．瘤胃内微生物氮代谢的研究

2．瘤胃微生物氮循环研究

3．本课题的导出

4 理论假说的提出

5．实验论证的技术路线

6．研究意义及目标

第二篇 试验研究

第一章 瘤胃原虫与细菌之间氮周转方法的建立----荧光光度法在瘤胃原虫对细菌吞噬作用研究中的应用

引言

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

4 小结

第二章 不同日粮精粗比对瘤胃原虫与细菌之间氮周转的影响

引言

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

4 小结

第三章 不同碳源结构NSC／SC对瘤胃原虫与细菌间氮周转的影响

引言

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

4 小结

第四章 不同分子结构氮源对瘤胃原虫与细菌间氮周转的影响

引言

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

4 小结

第五章 不同单体氨基酸对瘤胃原虫与细菌之间的氮周转的影响

引言

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

4 小结

第六章 不同原虫控制剂对瘤胃微生物氮周转作用的影响

引言

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

4 小结

全文总论与研究展望

1 全文讨论

1．1 瘤胃原虫与细菌之间氮素周转研究方法探讨

1．2 瘤胃原虫与细菌之间氮素循环的规律

1．3 瘤胃内环境氮素周转与微生物氮素周转的关系

1．4 瘤胃微生物种群结构与微生物氮素周转的关系

1．5 瘤胃原虫与细菌之间氮素周转的影响机制

2 全文结论

3 研究创新点

4 研究展望

参考文献

致谢

攻读学位期间发表的学术论文目录

声明