膜胆固醇在肠道病原菌黏附和侵袭肠上皮细胞中作用探析

摘要

肠道病原菌是临床上引起人类或动物腹泻、呕吐、脱水、肠炎为主要症状的重要病因之一，严重的甚至可以引起死亡。主要的肠道病原菌包括致致病性大肠杆菌、沙门菌、空肠弯曲菌、单核李斯特杆菌和霍乱弧菌等，其感染第一步也是最重要一步就是对宿主肠上皮细胞进行有效地黏附，进而定植和侵袭感染。 脂筏是细胞膜脂质双分子层内含有特殊脂质的微区，微区内陷形成小窝，由丰富的胆固醇、鞘糖脂、鞘磷脂、磷脂、糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定蛋白和一些跨膜蛋白构成。脂筏与多种生物学活动密切相关，如跨膜信号转导、细胞凋亡、胆固醇运输、细胞内吞和胞吐的过程中蛋白质的分选。有文献报道脂筏还利于多种病毒对宿主细胞的入侵，并与病原细菌对宿主细胞的定植相关。 甲基-β-环糊精（Methyl-β-cyclodextrin，MβCD）是最常用的胆固醇溶解剂，对胆固醇有极强的亲和力，可减少脂筏中胆固醇的含量，从而破坏脂筏结构但不影响细胞膜的完整性。本研究首先利用MβCD去除人结肠癌细胞Caco-2以及仔猪空肠上皮细胞IPEC-J2细胞膜胆固醇，破坏脂筏结构，通过WST-1细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒测定不同浓度和不同时间MβCD作用Caco-2和IPEC-J2细胞的毒性。结果显示，小于2 mMMβCD对Caco-2和IPEC-J2细胞均无明显毒性作用;2 mM MβCD处理Caco-2和IPEC-J2细胞1h以内对细胞无明显毒性作用。因此，以最佳条件使用2 mM MβCD分别处理Caco-2和IPEC-J2细胞1h，回补组细胞在MβCD处理后添加外源性胆固醇孵化1h，对照组细胞以培养基孵育。然后分别与人源ETEC标准株H10407、猪源K88ac+ ETEC标准株C83902，猪源F18ab+ ETEC标准株F107/86以及广谱宿主菌肠炎沙门（S.enteritidis）标准株50336共孵育，通过检查病原菌对细胞的黏附和侵袭情况，探究膜胆固醇在细菌黏附、定植和侵袭宿主细胞过程中的作用。结果显示，去除膜胆固醇后ETEC H10407和S.enteritidis50336对Caco-2细胞的黏附与对照组相比分别显著下降23％和33％，对Caco-2细胞的侵袭与对照组相比分别显著下降30％和25％;K88ac+ ETEC C83902、F18ab+F107/86和S.enteritidis50336对IPEC-J2细胞的黏附与对照组相比分别显著下降29％、23％和27％，F18ab+F107/86、S.enteritidis50336对IPEC-J2细胞的侵袭与对照组相比分别显著下降21％和31％;而当对去除膜胆固醇的Caco-2细胞或者IPEC-J2细胞添加外源性的胆固醇时，所有的上述肠道病原菌对细胞系的黏附和侵袭均恢复到对照组的正常水平。综上结果，本研究揭示了膜胆固醇在肠道病原菌黏附、定植和侵袭宿主肠上皮细胞中的作用，为进一步深入研究肠道病原菌的致病机制以及完善细胞脂筏的功能提供理论依据。

目录

摘要

符号说明

第一部分 文献综述

综述一 主要肠道病原菌研究进展

1．产肠毒素大肠杆菌研究进展

2 肠炎沙门菌研究进展

参考文献

综述二 细胞膜脂筏研究进展

1．脂筏的组成

2．生物学功能

3．在病原体感染中的作用

参考文献

第二部分 实验研究

研究一、MβCD去除细胞膜胆固醇对肠上皮细胞的细胞毒性作用分析

引言

1．材料

2 方法

3 结果

4 讨论

参考文献

研究二、胆固醇在肠道病原菌黏附、侵袭肠上皮细胞中作用的研究

引言

1．材料

2 方法

3 结果

4 讨论

参考文献

全文小结

致谢

攻读硕士期间发表的学术论文

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