猪精原干细胞分离培养鉴定及诱导分化的研究

摘要

精原干细胞(pig spermatogonial stem cells，pSSCs)位于曲细精管基膜上，既能自我更新并维持自身数量，又能定向分化产生其他细胞的成体干细胞，是雄性体内唯一可将遗传物质传递给后代的永生细胞。正因为SSCs的可塑性，使其能替代胚胎干细胞(ESCs)用于治疗和遗传修饰，而不涉及伦理和免疫排斥问题，为其应用开辟了广阔的前景。然由于生殖细胞分化机制及关键基因与诱导剂互作调控细胞分化的机制仍不清楚，导致SSCs诱导分化重复性差和效率低，体外诱导SSCs难以获得功能齐全的体细胞，满足不了研究和生产实践的需求。目前，小鼠SSCs的分离培养及诱导分化体系已经较为成熟，而大动物的相关研究还比较滞后。所以本研究主要进行姜曲海猪SSCs的分离、培养、鉴定及诱导分化，并检测诱导分化过程中关键基因的表达，为体外建立猪SSCs培养体系及探究SSCs体外诱导分化相关基因调控机制打下基础。 1、本研究以姜曲海猪为细胞来源材料，取4～7日龄猪睾丸，分离得到细胞悬液，差速贴壁法分离得到SSCs和支持细胞。发现经3次差速贴壁能较好的分离SSCs和支持细胞，3次差速时间分别为2h、2h和1h。分离得到的支持细胞用作饲养层细胞。 2、为了更好的在体外长期培养猪SSCs，我们比较了SSCs的传代方法:挑克隆传代和胰酶消化传代，实验证明挑克隆传代有利于防止饲养层急速过快增长，从而有利于SSCs的增殖。我们还比较了SSCs在丝裂霉素-C处理过的支持细胞饲养层上与直接和支持细胞共培养的生长情况，最终确定用丝裂霉素-C处理过的支持细胞作为培养SSCs的饲养层。同时，我们还发现饲养层细胞在用过2至3次后更换新的支持细胞，更有利于SSCs的增殖。我们在体外培养最长达6个月，传至20代。 3、分离的SSCs在饲养层细胞上和含有因子的培养基中形成克隆细胞团簇，并可传代后继续增殖。免疫鉴定结果显示姜曲海猪SSCs表达intergrin-β1、Daz1、SOX2、SSEA1干细胞特异性蛋白，这证明了获得的SSCs能较好的保持未分化状态。 4、待SSCs传至3代后，添加不同的化学诱导剂分别诱导SSCs向神经元样细胞、脂肪细胞和成骨细胞分化，每天观察并作好记录。8d成功诱导SSC成为神经元样细胞，甲苯胺蓝染色及NSE抗体鉴定成阳性;16d诱导SSC成为成骨细胞，ALP、Von Kossa染色及Collagon1抗体鉴定均呈阳性;22d诱导SSC成为脂肪细胞，油红O染色可见脂滴被染成红色;qRT-PCR结果显示，Nestin和β-tubulin在6d左右表达量最高，Cbfa1和Osterix在12d左右表达量最高，PPARγ和C/EBPa在18d左右表达量最高。 综上，本研究在添加因子培养基和支持细胞做饲养层的培养体系下体外培养猪SSCs，用挑克隆传代和更换新鲜饲养层的方法，在体外维持猪SSCs存活增殖6个月，为以后猪SSCs体外增值培养提供参考。另外，本实验成功诱导SSCs向神经元样细胞、脂肪细胞和成骨细胞分化，并检测分化过程中关键基因的表达，为探究猪SSCs体外诱导分化相关基因调控机制打下了基础。

目录

论文说明

摘要

符号表(缩略语表)

主要仪器

第一章 文献综述

1 引言

1．1 精原干细胞的起源及精子发生

1．2 精原干细胞的特征

1．3 精原干细胞的分离纯化方法

1．4 睾丸支持细胞及其对SSCs的作用

1．5 精原干细胞多能性研究

1．6 精原干细胞体外分化机制

1．7 精原干细胞的移植

1．8 精原干细胞的应用前景

1．9 本实验研究目的及意义

第二章 精原干细胞及支持细胞的分离培养与鉴定

1 材料与方法

1．1 实验材料

1．2 主要实验器材

1．3 主要试剂

1．4 实验方法

2 实验结果

2．1 精原干细胞的形态学观察

2．2 精原干细胞的AKP及免疫荧光染色

2．3 支持细胞的形态学观察

2．4 支持细胞的油红O染色

2．5 精原干细胞的传代培养

3 讨论

第三章 精原干细胞的诱导分化及鉴定

1 材料与方法

1．1 实验材料

1．2 实验主要仪器

1．3 主要试剂

1．4 实验方法

2 实验结果

2．1 SSCs诱导体系的建立

2．2 SSCs向神经元样细胞诱导分化形态变化过程及鉴定

2．3 SSCs向成骨细胞诱导分化形态变化过程及鉴定

2．4 SSCs向脂肪细胞诱导分化形态变化过程及鉴定

2．5 qRT-PCR检测结果

3 讨论

全文结论

参考文献

致谢

硕士期间发表的论文

声明