小鼠精原干细胞的分离、长期培养及诱导分化的初步研究

摘要

精原干细胞(spermatogonial stem cell，SSC)具有自我更新能力又能分化为成熟精子，是雄性动物体内唯一能将遗传信息传递给子代的成体干细胞。对其体外增殖培养体系的建立以及诱导分化的研究不仅为哺乳动物遗传信息的保存提供技术支持，也为精子发生机制的研究提供重要的实验依据。目前，小鼠精原干细胞（mouse spermatogonial stem cell，mSSC）体外分离及长期培养的研究相对比较成熟。但是，mSSC的分离纯化方法操作繁琐、培养体系成本较高，各个实验室建立的培养体系不同，这给 SSC的深入研究带来诸多不便。因此，有必要建立一种简便有效的分离、扩增mSSC的培养方法，为SSC进一步深入研究奠定基础。 在借鉴国内外研究成果以及反复摸索基础之上，我们成功建立了一种支持细胞与 mSSC细胞共培养的 mSSC原代分离、培养方法，该方法不仅操作简便，而且克隆形成率高，mSSC生长迅速，2天即可有明显的葡萄串状克隆形成。更为重要的是，该方法在分离、培养 mSSC细胞的过程中不需要使用 StemPro-34干细胞培养基以及多达十几种的添加物和多种生长因子，仅需要使用常规的DMEM高糖培养基和GDNF和 bFGF等3种生长因子。目前，我们采用该方法不仅从昆明小鼠中建立了可长期稳定传代的 mSSC细胞系，而且从具有 non-DAB/2遗传背景的C57BL/6小鼠中也建立了可长期稳定传代的mSSC细胞系。 采用该方法建立的 mSSC细胞系不仅可在以小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblast，MEF)为饲养层的条件下稳定生长，而且在以支持细胞（Sertoli细胞）为饲养层的环境下也可稳定生长。碱性磷酸酶染色、RT-PCR和间接免疫细胞化学法初步鉴定所培养的细胞为mSSC。用维甲酸(retinoic acid，RA)诱导mSSC分化为单倍体生殖细胞，用RT-PCR法、间接免疫细胞化学法、流式细胞技术鉴定单倍体生殖细胞。结果表明：RA可在体外将mSSC诱导分化为单倍体生殖细胞。 本研究所建立的 mSSC分离、培养方法，不仅操作简便、而且大大降低了SSC研究的成本，为后续精子发生机制的研究以及其它物种 SSC细胞的分离、培养提供了很好地技术参考。

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前言

第一部分 小鼠精原干细胞的分离、纯化、培养及初步鉴定

材料与方法

1 材料

2 方法

3 mSSC的检测

4 结果

5 讨论

第二部分 小鼠精原干细胞的体外诱导分化及鉴定

材料与方法

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

全文小结

参考文献

致谢

综述:非灵长类动物精原干细胞及其多潜能性的研究进展

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