鸡传染性喉气管炎病毒抗体间接ELISA检测方法的建立和亚单位疫苗研制

摘要

鸡传染性喉气管炎(ILT)是由传染性喉气管炎病毒(ILTV)引起的急性呼吸道疾病，给养鸡业造成巨大的经济损失。目前ILT的防控主要依赖疫苗接种，常用的疫苗是减毒活疫苗。但是减毒疫苗容易引起毒力返强，导致本病的发生和流行。因此，建立ILTV抗体的检测方法，以及研制保护力好、安全性高的新型疫苗，对于ILT的防控具有重要意义。 本研究通过对ILTVAnhui-2011-2株gD基因所编码蛋白的信号肽和跨膜结构分析，用PCR扩增编码gD糖蛋白胞外区的基因片段(253nt～1218nt)，并克隆到供体质粒pFastBacHTA中。将其转化到感受态细胞DH10Bac/AcMNPV中进行转座，再经过筛选纯化得到穿梭质粒Bacmid-gD。用脂质体介导穿梭质粒转染Sf9细胞，得到重组杆状病毒AcMNPV-gD。用Western-blot可以检测到AcMNPV-gD的表达产物大小为50KD左右，并且与鸡抗ILTV多抗血清特异性结合。以高亲和Ni-NTA层析树脂纯化重组杆状病毒表达的gD蛋白，建立了检测ILTV抗体的间接ELISA方法。该方法与BioChek公司商品化试剂盒相比符合率为93.02％，与新城疫、H9亚型禽流感和传染性支气管炎阳性血清均无交叉反应。 以重组杆状病毒表达的gD蛋白制备了亚单位疫苗。在免疫保护试验中，设立了亚单位疫苗(Sv-gD)组、重组马立克氏病毒疫苗（表达gD的MDVCVI988/Rispens，rMDV-gD）组、联合免疫组(rMDV-gD+Sv-gD)、活疫苗(K317)组和攻毒对照组，从发病率、死亡率、临床症状、增重影响和抗体水平等方面评价免疫效力。其中，重组马立克氏病毒疫苗组和联合免疫组于1日龄时分别以5000PFU/鸡的rMDV-gD免疫;21日龄时，亚单位疫苗组和联合免疫组以50μg/鸡的亚单位疫苗免疫，活疫苗组以1羽份K317疫苗免疫。所有试验组于42日龄用105EID50/鸡的ILTV标准强毒王岗株进行攻毒。联合免疫组攻毒后的发病率(27％)和死亡率(13％)与攻毒对照组的发病率(100％)和死亡率(67％)存在显著差异(p＜0.05)。攻毒前后（42～52日龄），联合免疫组与活疫苗组相比，体重增加显著(p＜0.05)。临床症状评分结果显示联合免疫组与重组马立克氏病毒疫苗组及亚单位疫苗组之间均显著差异(p＜0.05)。综上可见，亚单位疫苗可以加强重组马立克氏病毒疫苗防控ILT的免疫保护效率。

目录

摘要

符号说明

第一章 综述 鸡传染性喉气管炎研究进展

1 病毒形态与基因组结构

2 病毒转录和复制

3 病毒主要蛋白和功能

4 检测方法

4．1 病原检测

4．2 核酸检测

4．3 血清学检测

5 疫苗研究进展

第二章 鸡传染性喉气管炎抗体间接ELISA检测方法的建立和亚单位疫苗研制

1 材料

1．1 病毒株、菌种、细胞和质粒

1．2 鸡胚和实验动物

1．3 血清

1．4 主要试剂

1．5 设备与耗材

1．6 分子生物学软件

2 方法

2．1 表达ILTV gD重组杆状病毒的构建

2．2 检测ILTV抗体的间接ELISA方法的建立

2．3 gD蛋白亚单位疫苗制备与免疫效力试验

3 结果

3．1 表达ILTV gD重组杆状病毒的构建与鉴定

3．2 间接ELISA检测方法的建立

3．3 免疫效力评价

4 讨论

全文总结

参考文献

致谢

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