华东地区Q型烟粉虱对新烟碱类杀虫剂的抗性监测及其靶标基因克隆

摘要

烟粉虱Bemisia tabaci（Gennadius）是一种世界性农业害虫，其中B型与Q型是危害程度最为严重的两种生物型，相对于B型烟粉虱，Q型烟粉虱对杀虫剂的耐受能力更强，且对包括有机磷类、拟除虫菊酯类、新烟碱类和昆虫生长调节剂等大部分杀虫剂产生了不同程度的抗药性，其中尤以对新烟碱类杀虫剂的抗性问题最为突出。本文对我国华东地区8个Q型烟粉虱田间种群对新烟碱类杀虫剂（吡虫啉、烯啶虫胺、噻虫嗪和呋虫胺）和氟啶虫胺腈抗药性水平进行了监测，通过RT-PCR克隆了Q型烟粉虱烟碱型乙酰胆碱受体β1亚基基因全长cDNA，并对Q型烟粉虱田间种群乙酰胆碱受体β1亚基是否存在抗性相关突变进行了检测。此外，运用基因组步移技术克隆了Q型烟粉虱抗性相关细胞色素P450CYP4C64基因侧翼区序列，并对B型和Q型烟粉虱CYP4C64基因5'侧翼区序列多态性进行了比对分析。
　　采用浸叶法对扬州、江阴、东台、和县、上海、合肥、杭州和南昌8个地区的Q型烟粉虱田间种群对新烟碱类杀虫剂的抗性水平进行了测定，结果表明，与敏感种群相比，8个地区Q型烟粉虱田间种群对吡虫啉和烯啶虫胺产生低至中等水平抗性，抗性倍数分别为4.07-21.75倍和3.37-16.14倍。除了扬州种群对噻虫嗪产生高水平抗性(RF40.38)外，其他种群对噻虫嗪产生低水平抗性，抗性倍数为3.50-8.58倍。8个地区的烟粉虱田间种群对呋虫胺与氟啶虫胺腈较敏感，其中南昌种群对呋虫胺和氟啶虫胺腈的敏感性最高（RF分别为0.5和0.41），表明呋虫胺和氟啶虫胺腈与毗虫啉、烯啶虫胺和噻虫嗪之间不存在交互抗性。
　　通过RT-PCR克隆了烟粉虱乙酰胆碱受体β1亚基基因1597bp全长cDNA，编码氨基酸序列与桃蚜Myzus persicae乙酰胆碱受体β1亚基的一致性为84.8％。对Q型烟粉虱田间种群乙酰胆碱受体β1亚基的序列分析发现，在8个地区烟粉虱田间种群中存在23个核苷酸多态性位点，导致编码19个氨基酸发生替换。虽然在D环上对应桃蚜对吡虫啉抗性相关T81R突变的R78氨基酸没有发生突变，但在江阴种群中发现了位于D环的45个碱基的片段缺失，该缺失片段编码的15个氨基酸包含了R78。
　　利用基因组步移方法获得烟粉虱抗性相关细胞色素P450基因CYP4C64的5'和3'侧翼基因组序列。利用CONSITE软件对CYP4C645'侧翼基因组序列进行分析，发现了多个转录因子结合位点，包括51个GATA-1、24个Ahr-ARNT、7个CREB、2个NRF-2和33个Broad-complex-4。对B型敏感种群和Q型田间种群烟粉虱CYP4C64基因5'侧翼序列进行的序列比对发现，与B型敏感种群相比，Q型烟粉虱田间种群CYP4C64基因5'侧翼区存在一个260bp的转座子插入，该转座子序列含有多个转录因子结合位点，包括3个Ahr-ARNT，7个Broad-complex-4和1个NRF-2。

目录

摘要

第一章 文献综述

1．烟粉虱概述

2．新烟碱类杀虫剂概述

3．烟粉虱对新烟碱类杀虫剂的抗性现状

4．烟粉虱对新烟碱类杀虫剂的代谢抗性机制

5．昆虫对新烟碱类杀虫剂的靶标抗性机制

6．研究目的和意义

第二章 华东地区Q型烟粉虱对新烟碱类杀虫剂的抗性监测

2．1 材料和方法

2．1．1 供试昆虫

2．1．2 供试药剂

2．1．3 生物测定

2．1．4 数据处理

2．2 结果分析

2．2．1 对吡虫啉抗性水平

2．2．2 对烯啶虫胺抗性水平

2．2．3 对噻虫嗪抗性水平

2．2．4 对呋虫胺抗性水平

2．2．5 对氟啶虫胺腈抗性水平

2．3 讨论

第三章 Q型烟粉虱乙酰胆碱受体β1亚基基因的克隆和序列多态性分析

3．1 材料与方法

3．1．1 供试虫源

3．2 主要试剂和仪器

3．2．1 主要试剂

3．2．2 主要仪器

3．3 试验方法

3．3．1 烟粉虱RNA提取

3．3．2 RT-POR所用cDNA模板的合成

3．3．3 烟碱乙酰胆碱受体β1亚基基因引物设计

3．3．4 PCR反应体系

3．3．5 感受态细胞制备

3．3．6 PCR产物与载体连接

3．3．7 连接产物转化

3．3．8 单菌落PCR检测

3．3．9 测序

3．3．10 序列分析

3．4 结果分析

3．4．1 Q型烟粉虱乙酰胆碱受体β1亚基基因全长cDNA克隆和序列分析

3．4．2 不同地理种群烟粉虱乙酰胆碱受体β1亚基序列多态性分析

3．5 讨论

第四章 烟粉虱抗性相关CYP4C64基因侧翼序列的分离和序列多态性分析

4．1 供试虫源

4．2 实验方法

4．2．1 CYP4C64基因5’和3’侧翼序列克隆

4．2．2 CYP4C64 5’侧翼区抗性相关多态性检测

4．2．3 序列分析

4．3 结果与分析

4．3．1 CYP4C64 5’端侧翼区序列分析

4．3．2 CYP4C64 3’端侧翼区序列分析

4．3．3 烟粉虱细胞色素P450 CYP4C64基因5’侧翼区序列多态性分析

4．4 讨论

参考文献

致谢

攻读学位期间发表或待发的学术论文

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