高温胁迫对西花蓟马抗氧化酶活性的影响及CAT基因的克隆与表达

摘要

西花蓟马是为害园艺作物和经济作物的世界性害虫。该虫子2003年首次在北京发现，之后迅速蔓延至我国的大部分地区，为害日益严重。西花蓟马在入侵过程中，常常遭受夏季高温胁迫，但这并未能限制其种群的快速扩张。本文采用生理生化和分子生物学的方法，分析抗氧化酶系统在高温胁迫条件下的作用，以了解西花蓟马对高温胁迫的耐受机制，为西花蓟马种群扩散研究提供理论依据。主要研究结果如下:
　　1.研究了高温胁迫对西花蓟马抗氧化酶活性的影响。结果表明，西花蓟马受到0.5、1和2h的高温胁后，超氧化物歧化酶、过氧化物酶和过氧化氢酶的活性显著升高而后降低;谷胱甘肽-S-转移酶的活性则在0.5h高温处理条件下显著升高，而在1和2h高温胁迫下活性变化不显著。说明西花蓟马抗氧化酶系统能够有效抵御高温胁迫对其造成的氧化损伤。
　　2.通过RT-PCR技术克隆了7个西花蓟马内参基因的部分片段，包括18S rRNA、EF-1、GAPDH、H3、TUB、ACT和RPL32。利用qRT-PCT技术研究了西花蓟马7个内参基因在不同实验条件下的稳定性，运用常用的内参基因筛选程序(NormFinder、geNorm和BestKeeper)以及比较ACt法对各内参基因进行了排名，最后使用RefFinder网页程序进行综合评估，得出最佳的内参基因方案。最合适的内参基因组合如下:不同发育阶段为EF-1和RPL32;高温胁迫为RPL32和GAPDH;低温胁迫为18S和EF-1;高温时间梯度为TUB和GAPDH;低温时间梯度为EF-1和TUB。最后，对筛选的内参基因进行验证，表明内参基因的筛选对目的基因定量研究标准化非常必须。
　　3.采用RT-PCR和RACE的方法从西花蓟马中克隆得到过氧化氢酶基因，命名为FoCAT。FoCAT的cDNA全长为1870bp，开放阅读框为1521bp，编码506个氨基酸，预测分子量为57.11kda。序列分析表明，FoCAT十分保守，与其他昆虫的CAT具有很高的相似性，FoCAT具有两个CAT家族的签名序列，这也表明FoCAT属于CAT基因家族的一员。采用实时定量PCR研究了西花蓟马过氧化氢酶基因在不同发育历期和不同温度条件下的表达模式。结果表明高温胁迫能诱导CAT的表达，而低温胁迫对CAT表达的影响不显著;CAT在西花蓟马二龄若虫阶段表达量显著高于其它龄期的表达量;不论是高温还是低温不同时间梯度处理均导致CAT表达量显著上调，且在处理2h达到最高值。
　　综上所述，西花蓟马能够耐受较强的高温胁迫是其迅速入侵扩散的重要基础，其内在机制可能与抗氧化酶系统抵御高温胁迫免受损伤有关。

目录

论文说明

摘要

第一章 文献综述

1 高温胁迫与昆虫的关系

1．1 高温胁迫对昆虫的影响

1．2 昆虫对高温胁迫的生理生化适应机制

2 抗氧化酶系统

2．1 超氧化物歧化酶

2．2 过氧化氢酶

2．3 过氧化物酶

2．4 谷觥甘肽-S-转移酶

3 西花蓟马的研究进展

3．1 西花蓟马概述

3．2 高温对西花蓟马的影响

第二章 西花蓟马对高温胁迫的抗氧化反应

1 材料与方法

1．1 供试虫源

1．2 供试昆虫高温处理

1．3 粗酶液的提取

1．4 西花蓟马蛋白质含量的测定

1．5 抗氧化酶活性测定

1．6 数据处理

2 结果与分析

3．1 高温对西花蓟马若虫SOD活性的影响

3．2 高温对西花蓟马若虫CAT活性的影响

3．3 高温对西花蓟马若虫POD活性的影响

3．4 高温对西花蓟马若虫GSTs活性的影响

3 小结与讨论

第三章 西花蓟马内参基因的筛选与验证

1 材料与方法

1．1 供试虫源

1．2 实验方法

1．3 用于实时定量的cDNA的合成

1．4 候选基因的克隆与实时定量的引物设计

1．5 西花蓟马候选内参基因实时定量分析

1．6 目的基因的评价与验证

1．7 数据处理

2 结果与分析

2．1 总RNA的含量和PCR扩增效率

2．2 候选内参基因的表达谱

2．3 候选内参基因表达稳定性分析

2．4 内参基因稳定性验证

3 小结与讨论

第四章 西花蓟马过氧化氢酶基因的克隆与表达

1 实验材料

1．1 供试昆虫

1．2 主要试剂

1．3 主要仪器

2 实验方法与步骤

2．1 西花蓟马CAT基因的克隆

2．2 西花蓟马CAT基因的表达模式分析

3 结果与分析

3．1 西花蓟马CAT基因的克隆与分析

3．2 西花蓟马CAT的表达模式分析

4 小结与讨论

参考文献

硕士在读期间发表的研究生论文

致谢

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