副猪嗜血杆菌的分离鉴定与三价灭活疫苗的初步研制

摘要

副猪嗜血杆菌常存在于健康猪的上呼吸道，属于巴斯德菌科嗜血杆菌属，在临床上主要引起猪的多发性浆膜炎和关节炎。近年来国内养猪场副猪嗜血杆菌病的日益严峻，对各养殖场造成严重的损失。本研究主要对江苏省和安徽省养猪场的病死猪和健康猪进行副猪嗜血杆菌的分离鉴定，为副猪嗜血杆菌的防治提供依据。同时，本室初步研制副猪嗜血杆菌血清4型、5型和12型三价灭活疫苗，用BALB/c小鼠对其进行免疫保护力的评价。
　　1.副猪嗜血杆菌的分离鉴定
　　在扬州大学动物医院和扬州某屠宰场进行样品采集，将其接种到巧克力培养基上培养，通过PCR检测副猪嗜血杆菌的16 S rRNA。对PCR检测阳性的菌株进行纯化并保存。
　　通过PCR鉴定之后，从病死猪中分离到8株副猪嗜血杆菌;从健康猪中分离到26株副猪嗜血杆菌，其分离率为7.12％。对其中的三株副猪嗜血杆菌进行基因测序，其测序结果与国内外分离株16 S rRNA基因序列同源性均能达到99％以上。
　　对所有分离株用玻板凝集进行血清分型。在病死猪的分离株中血清5型3株、血清12型2株、血清14型1株及不可定型2株。在健康猪的分离株中血清4型4株(15.38％)、5型1株(3.85％)、11型3株(11.54％)、12型10株(38.46％)、13型1株(3.85％)及未定型菌株7株(26.92％)。
　　2.副猪嗜血杆菌三价灭活疫苗的初步研制
　　用副猪嗜血杆菌血清4型、5型和12型分离株分别对豚鼠进行腹腔攻毒。结果血清5型和12型菌株攻毒豚鼠全部死亡;血清4型菌株攻毒豚鼠死亡1只（攻毒2只）。对死亡豚鼠进行剖检发现腹腔积液和胸腔积液及少量纤维素渗出，与副猪嗜血杆菌在病猪的症状相似。
　　用三个不同剂量的副猪嗜血杆菌血清4型、5型和12型分离株分别对BALB/c小鼠进行腹腔攻毒。结果三个血清型的菌株攻毒剂量达到5.0×109 CFU时，BALB/c小鼠均死亡。而攻毒剂量为1.0×109 CFU时，血清4型和5型菌株攻毒小鼠均死亡1只（攻毒2只），而血清12型菌株攻毒小鼠未死亡。
　　用三价灭活疫苗1（含3个血清型菌株各1.0×109 CFU）、三价灭活疫苗2（含3个血清型菌株各2.0×109 CFU）、三价灭活疫苗3（含3个血清型菌株各4.0×109 CFU）及商品灭活疫苗分别对BALB/c小鼠进行皮下免疫2次，二次免疫后14天，对各小鼠进行腹腔攻毒。结果三价灭活苗免疫组1和2与商品疫苗免疫组对4型和5型菌株的抵抗力相当，保护率为40％左右。但在对12型菌株的抵抗力上，三价灭活疫苗免疫组1和2的保护率达到60％，而商品疫苗的保护率只有20％。三价灭活疫苗免疫组3对4型和5型菌株的免疫保护率要比商品疫苗免疫组保护率高20％，保护率为60％。在对12型菌株的抵抗力上，三价灭活疫苗免疫组3的保护率要比商品疫苗免疫组的保护率高60％，达到80％。综上所述，本研究初步研制的副猪嗜血杆菌三价灭活疫苗的免疫保护效果要优于商品灭活疫苗的免疫保护效果，对副猪嗜血杆菌血清4型、5型及12型具有较好的免疫保护能力。

目录

摘要

符号说明

第一章 副猪嗜血杆菌的研究进展

1 病原掌

2 分型方法的研究

2．1 血清学分型

2．2 分子生物学分型

3 临床诊断学研究进展

3．1 病原学诊断

3．2 血清学诊断

3．3 临床症状及病理变化诊断

3．4 免疫组化检测

4 副猪嗜血杆菌疫苗的研究进展

参考文献

第二章 副猪嗜血杆菌的分离鉴定

1 实验材料

1．1 病料来源

1．2 主要试验仪器

1．3 主要培养基和试剂

1．4 细菌菌种

1．5 培养基和主要试剂的配制

1．6 实验动物

1．7 副猪嗜血杆菌标准血清

2 试验方法

2．1 副猪嗜血杆菌的分离

2．2 PCR鉴定

2．3 菌株的保存

2．4 血清分型

2．5 ERIC-PCR分型

3 结果与分析

3．1 培养基的选择

3．2 副猪嗜血杆菌的分离结果

3．3 PCR检测的特异性与敏感性

3．4 16 S rRNA检测结果

3．5 分离株的血清分型

3．6 各血清型在病死猪和健康猪的分布情况

3．7 ERIC-PCR分型结果

4 讨论

4．1 副猪嗜血杆菌的分离

4．2 副猪嗜血杆菌的保存

4．3 副猪嗜血杆菌的分型

参考文献

第三章 副猪嗜血杆菌三价灭活苗的初步研制

1 实验材料

1．1 菌株来源

1．2 实验动物

1．3 主要试验仪器

1．4 主要培养基和试剂

1．5 疫苗佐剂

1．6 试验用灭活疫苗

1．7 主要试剂和培养基的配制

1．8 副猪嗜血杆菌阳性血清和阴性血清

2 试验方法

2．1 细菌计数

2．2 动物感染试验

2．3 副猪嗜血杆菌三价灭活疫苗的制备

2．4 副猪嗜血杆菌疫苗对BALB／c小鼠的免疫保护试验

3 结果与分析

3．1 细菌计数情况

3．2 副猪嗜血杆菌对豚鼠的感染

3．3 副猪嗜血杆菌对BALB／c小鼠的感染

3．4 BALB／c小鼠血清抗体水平

3．5 副猪嗜血杆菌疫苗对BALB／c小鼠的免疫保护情况

3．6 小鼠病理切片结果

4 讨论

参考文献

全文小结

致谢

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