南蛇藤总萜调控CSN6蛋白抑制结直肠癌的作用及机制研究

摘要

引言
　　结直肠癌，发病率位于全世界常见恶性肿瘤的第3位，在消化道肿瘤中发病率仅次于胃癌和食管癌。在中国上海地区，结直肠癌患病率在各癌症中排列第3位，发病率为23.5/10万，而死亡率为11.8/10万。结直肠癌的临床症状以腹泻、便秘、肿块、便血、贫血、肠梗阻为主，晚期多出现肝、肺和腹腔内转移，西医诊断主要通过直肠指诊、x线造影、内窥镜检查和病理检验确定。约半数结直肠癌患者可生存5年左右。外科手术切除和放射治疗是治疗结直肠癌常用的治疗手段，但其单独治疗疗效不佳，为了预防癌的复发和转移，减轻患者痛苦，提高生活质量，越来越多的植物源化合物被用于抗癌的药物治疗和化学预防。Newman等统计在1981-2006年间，所有被批准的抗癌药物中，约73％的药物是属于天然产品药物，或者是基于天然产品的系列药物，天然药物因其多靶点、多环节和多途径的抗肿瘤作用，日渐成为临床抗肿瘤药物研究的热点。
　　南蛇藤（Celastrus orbiculatus Thunb.）为卫矛科南蛇藤属落叶木质藤本植物，其茎、根、叶和果均可入药，现代工艺从南蛇藤叶、根皮、茎、叶、种子等部位分离到多种成分，主要有倍半萜、三萜类、黄酮类、有机酸类、甾体类、鞣质等，具有抗肿瘤、抗炎、抗病毒、抗菌、抗氧化等多种作用。其中，南蛇藤茎乙酸乙酯总萜(C.orbiculatus ethyl acetate extract，COE)的抗肿瘤作用已被广泛证实，以往的研究多集中在对肿瘤细胞的增殖、凋亡、侵袭转移和血管生成等方面，关于其在肿瘤细胞自噬与凋亡方面的研究甚少。
　　前期研究发现，COE可抑制人结直肠癌HT-29细胞的增殖，诱导细胞自噬和凋亡，同时发现COE可降低CSN6蛋白表达水平。CSN6属于CSN的第六亚基，对于哺乳动物的生长发育非常重要，CSN6基因缺失或蛋白降解都会导致胚胎的死亡，从这些死亡的胚胎中可以发现p53及p21升高及细胞凋亡，在多种肿瘤中也发现CSN6过表达，其主要功能是调控蛋白质泛素化过程中的泛素连接酶(ubiquitin-ligase enzyme，E3)活性而起作用，但是，CSN6对结直肠癌细胞凋亡与自噬的调节作用还不很清楚，CSN6是否参与COE抑制结直肠癌的作用未见报道。因此，本实验拟研究CSN6分子是否参与调节COE诱导的HT-29细胞凋亡与自噬。
　　本课题共分为三部分研究内容。
　　第一部分:CSN6、Myc蛋白在人结直肠癌组织中的表达及临床意义
　　目的:检测结直肠癌组织及癌旁组织中CSN6、Myc表达，分析CSN6和Myc两者相关性，并分析其在结直肠癌发生、发展及转移过程中的临床意义。
　　方法:选择2012年1月至2014年12月手术切除后并经病理证实的结直肠癌患者48例，采用免疫组织化学的方法检测CSN6、Myc蛋白在人结直肠癌组织和癌旁正常组织中的表达情况;逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测癌组织及癌旁肠组织中CSN6mRNA、Myc mRNA，用x2检验或者Fisher确切概率法对资料进行描述，所有数据均采用SPSS19.0进行统计学分析。
　　结果:免疫组织化学:CSN6蛋白阳性反应呈棕黄色，存在于结直肠癌细胞的细胞浆或胞核中，CSN6在结直肠癌中阳性表达率为70.8％(34/48)，癌旁组织阳性表达率为10.4％(5/48);Myc在癌组织中的过表达率为83.3％，高于癌旁组织，差异有显著性(P＜0.05); RT-PCR示，CSN6mRNA和Myc mRNA在结直肠癌组织和癌旁组织中均有不同程度的表达，约75％(36/48)癌组织中CSN6 mRNA表达水平高于癌旁组织，77.09％(37/48)癌组织中MycmRNA表达水平高于癌旁组织，差异均有统计学意义(p＜0.001);二者表达呈正相关(r=0.652，p=0.041); CSN6 mRNA，Myc mRNA在Dukes C期+D期表达上调，与A期、B期比较，差异有统计学意义(p＜0.05)，但A期与B期之间无显著性差异;CSN6mRNA，Myc mRNA的表达，在淋巴结转移阳性与阴性组间有显著性差异(p＜0.05)，但在性别、年龄、病灶位置、组织类型等组间表达无显著性差异(p＞0.05)。
　　结论:(1)结直肠癌组织中CSN6mRNA、Myc mRNA的表达高于癌旁组织，差异有统计学意义，二者表达呈正相关(r=0.652，p=0.041);(2)癌组织中CSN6、Myc蛋白表达高于癌旁组织，差异有统计学意义(p＜0.05)。
　　第二部分:南蛇藤总萜诱导人结直肠癌HT-29细胞凋亡与自噬的实验研究
　　目的:从细胞自噬及凋亡关系角度探讨南蛇藤总萜(COE)抑制人结直肠癌HT-29细胞增殖的作用机制。
　　方法:选用不同浓度的COE处理体外培养的结直肠癌HT-29细胞，MTT法检查细胞存活率，电镜(TEM)观察细胞形态，流式细胞术(AnnexinⅤ，FITC-PI双染与PI单染法)检测细胞凋亡与细胞周期，免疫印迹法(Western blot)检测COE对细胞自噬及凋亡的相关蛋白表达的影响;为进一步探讨COE诱导的自噬对凋亡的影响，用自噬激动剂Rapamycin和抑制剂3-MA联合80 mg/L COE干预HT-29细胞，用吖啶橙染色细胞，并采用MTT法检测Rapamycin、3-MA调节自噬后，对COE抑制HT-29细胞增殖的影响。
　　结果:COE抑制HT-29细胞的增殖，呈时间、剂量依赖性，作用24h的IC50为149.65μg/mL。随着COE浓度的升高，TEM示细胞中凋亡小体及自噬体明显增多，细胞凋亡率也明显高于对照组，并且COE诱导HT-29细胞周期停滞于GOG1期，呈浓度依赖性;和COE治疗组比较，COE联合3-MA组的细胞生存率、AVO的数量显著下降，免疫印迹分析，COE联合3-MA组的LC3-Ⅱ蛋白表达也降低，相反，COE联合Rapamycin组的AVO量增加、LC3-Ⅱ的表达上调，更重要的是，COE联合Rapamycin组与COE联合3-MA组比较，细胞生存率降低，这个结果表明，自噬可以促进COE抑制人结直肠癌HT-29细胞增殖。
　　结论:COE可诱导HT-29细胞凋亡与自噬，并且自噬可以协同COE抑制人结直肠癌HT-29细胞增殖。
　　第三部分:COE诱导结直肠癌细胞凋亡及自噬的分子机制
　　目的:探讨Akt-CSN6-Myc信号轴是否参与COE诱导HT-29细胞凋亡与自噬.
　　方法:首先用Western blot方法检测COE不同浓度组对CSN6蛋白及其下游基因相关蛋白Myc、P53表达的影响;接着研究CSN6对结直肠癌HT-29细胞增殖的影响，成功构建了CSN6过表达质粒，并获得了HT-29-MIGR1-CSN6细胞株，选用80mg/L浓度的COE处理HT-29-MIGR1、HT-29-MIGR1-CSN6细胞24 h，Western blot检测CSN6-Myc信号轴相关蛋白表达水平的变化，MTT法检测各组细胞生存率;并探讨Akt激酶对CSN6-Myc信号轴的影响，成功构建了Akt过表达质粒，并获得了HT-29-MIGR1-Akt细胞株，选用80mg/L浓度的COE处理Akt激酶过表达组（HT-29-MIGR1-CSN6细胞组）、Akt激酶抑制组（用PI3K抑制剂LY294002同时干预，终浓度50μM）24h，Western blot检测p-Akt、CSN6、Myc、p53等蛋白表达变化;最后探讨了COE对PI3K-Akt-mTOR信号传导通路的影响。
　　结果:随着COE浓度的增加，CSN6、Myc蛋白表达水平逐渐下降，p53表达水平反而上升，40、80、160mg/L COE组与control组的差异有统计学意义;qRT-PCR检测发现，CSN6 mRNA表达水平有一定的变化，但与control组比较无显著性差异(P＞0.05)，以上结果提示COE能够下调CSN6蛋白的表达水平，但其蛋白质水平的改变不是通过调节细胞中mRNA的水平来实现的;相比control组，COE组、COE+HT-29-MIGR1组、COE+HT-29-MIGR1-CSN6组细胞生存率明显下降，但是，COE+HT-29-MIGR1-CSN6组细胞生存率较COE组、COE+HT-29-MIGR1组，有所升高，以上实验结果说明， COE可通过降低CSN6蛋白表达，来抑制HT-29细胞的增殖;与control组比较，Akt激酶过表达组的Akt、p-Akt蛋白表达增高，其下游基因CSN6、Myc的蛋白表达水平也明显升高，p53蛋白表达下降，Akt激酶抑制组的Akt、p-Akt、CSN6、Myc蛋白表达结果与之相反，COE处理后，HT-29-MIGR1-Akt细胞组的p-Akt、CSN6、Myc蛋白表达明显下降，p53蛋白表达升高，上述结果说明，COE可抑制Akt磷酸化，从而下调CSN6蛋白水平;同时，随着COE浓度的增加，Akt-Thr308、mTOR-Ser2481、S6K-Thr389磷酸化水平逐渐下降，结果说明COE可通过抑制Akt磷酸化水平，下调mTOR、S6K的激酶活性从而抑制结直肠癌HT-29细胞增殖，诱导其凋亡，同时， mTOR活性的降低也可促进自噬的产生。
　　结论:COE通过影响Akt-CSN6-Myc信号轴诱导人结直肠癌HT-29细胞凋亡与自噬。另外，对PI3K-Akt-mTOR信号传导通路的抑制，也是COE治疗结直肠癌作用的机制之一。

目录

摘要

符号说明

前言

第一部分 CSN6、Myc蛋白在人结直肠癌组织中的表达及临床意义

1 材料

1．1 组织及病理切片来源

1．2 临床病理资料

1．3 实验试剂

1．4 主要仪器

1．5 主要试剂配制

2 方法

2．1 组织免疫组化染色

2．2 实时荧光定量PCR(RT-qPCR)

3 结果

3．1 资料分析

3．2 CSN6、Myc蛋白在结直肠癌组织中的表达

3．3 qRT-PCR检测CSN6结果

4．讨论

参考文献

第二部分 南蛇藤总萜诱导人结直肠癌HT-29细胞凋亡与自噬的实验研究

1 材料

1．1 药品

1．2 细胞株

1．3 实验试剂

1．4 主要仪器

1．5 主要试剂配制

1．6 引物设计

2 方法

2．1 药物准备

2．2 细胞培养

2．3 细胞活力实验(MTT法)

2．5 流式细胞仪检测COE对HT-29细胞周期的影响

2．6 流式细胞仪检测线粒体膜电位的改变

2．7 透射电镜样品制备与观察细胞凋亡小体与自噬体的形态：

2．8 Western blot实验

2．9 RT-PCR检测Beclinl mRNA、LC3 mRNA

2．10 统计学处理

3 结果

3．3 流式细胞仪检测检测COE对HT-29细胞凋亡的影响

3．5 流式细胞仪检测HT-29细胞线粒体膜电位

3．6 Western blotting分析COE对Bel-2家族蛋[刍及easpases酶的表达影响

3．7 COE诱导结直肠癌HT-29细胞自噬的产生

3．8 自噬激动剂Rapamycin和抑制剂3-MA调节自噬水平对COE抑制细胞增殖的影响

4 讨论

参考文献

第三部分 COE诱导结直肠癌细胞凋亡及自噬的分子机制

1 材料

1．1 药品

1．2 细胞株细胞、质粒和菌株

1．3 实验试剂

1．4 CSN6基因的编码序列克隆引物设定

1．5 主要仪器

1．6 主要试剂配制

2方法

2．1 药物准备

2．3 Western blot实验

2．5 重组逆转录病毒质粒MIGR1-CSN6、MIGR1-Akt的构建及鉴定

2．6 脂质体介导法转染细胞

2．7 流式细胞术检测转染效率

3．2 重组逆转录病毒质粒MIGR1-CSN6、MIGR1-Akt的构建及鉴定

3．3 筛选稳定过表达CSN6、Akt基因的结直肠癌细胞株

3．4 CSN6过表达对COE抑制HT-29细胞增殖的影响

3．5 Akt激酶过表达对CSN6-Myc信号轴的影响

3．6 COE对PI3K／Akt信号通路活化的影响

4．讨论

参考文献

综述一：单昧中药治疗结直肠癌的实验研究

综述二：自噬与肿瘤

致谢

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