紫枝玫瑰花色变异的转录组分析

摘要

玫瑰(Rosa rugosa Thunb.)是世界传统名花，拥有悠久的栽培历史，既是园林绿化和水土保持的优良植物材料，也广泛应用于香料、食品和化妆品行业。花色是观赏性植物的一个重要特性，玫瑰以其花香著称，但缺少像月季一样多变的花型和丰富的花色，紫枝玫瑰花红色且多季开花，目前在生产上大量应用，更有价值的是，紫枝玫瑰在花色上存在粉色和白色两种突变，是玫瑰花色研究的理想试验材料。本文以红花紫枝玫瑰及其花色变异品种粉花紫枝玫瑰和白花紫枝玫瑰为试材，采用液相色谱-质谱联用技术分析了其不同发育时期花瓣中花色素成分的种类及含量差异，并利用高通量测序技术，对其盛开期花瓣进行转录组测序，在此基础上，结合3种花色紫枝玫瑰基因表达谱的差异，筛选了与紫枝玫瑰花色变异相关的基因，并采用实时荧光定量PCR(Real-time PCR)技术验证了相关基因的表达特性，旨在初步揭示玫瑰花色形成的分子机理，为玫瑰花色改良及新品种培育奠定基础。主要研究结果如下:
　　1、采用HPLC-ESI-MSn技术，测定分析了3个紫枝玫瑰品种不同发育时期花瓣中的花色素组分及含量，结果表明:在红花紫枝和粉花紫枝中检测出3种花青苷，白花紫枝中仅检测到2种花青苷，其中矢车菊素菅是3种紫枝玫瑰共有的，芍药苷是红花紫枝和粉花紫枝共有的。在3个紫枝玫瑰品种中共检测到7种黄酮类化合物，主要是山奈酚类衍生物和槲皮素类衍生物，其中山奈酚-3-槐糖苷是3个紫枝玫瑰中共有且含量最高的黄酮类化合物，槲皮素-3-槐糖苷是3个紫枝玫瑰中共有且含量最高的槲皮素类衍生物。
　　2、在Illumina HiSeqTM2000的测序平台下，对3个紫枝玫瑰品种盛开期花瓣的混合样品进行了转录组测序。共得到103，364，222个reads，经过滤拼接组装后得到满足条件的51，332条All-unigene，其中长度大于1000bp的Unigenes有12，098条，占Unigene总数的23.57％。将获得的51，332个All-Unigene和已知的权威数据库NR、NT、Swiss-Prot、KEGG、COG和GO进行相似性序列比对(Evalue＜1.0e-5)，显示共有40，018(77.96％)个All-Unigene得到了功能注释，其中36，089个(70.32％) All-Unigene被注释到NR数据库;12，592个(24.53％) All-Unigene分25个类别被注释到COG;按照分子功能、细胞组分及参与的生物过程对25，975个(50.6％) All-Unigene基因进行了GO分类;共
　　有20，054个(39.07％) All-Unigene被注释到128条KEGG pathways中，这其中与花色合成相关的代谢途径中包含有316条(1.58％)被注释到苯丙氨酸合成途径，191条（0.95％)被注释到类黄酮合成途径，15条（0.07％)被注释到花青苷合成途径。
　　3、依照筛选标准evalue＜0.00001，按上述NR、Swiss-Prot、KEGG和COG权威蛋白数据库的优先级顺序，将All-Unigene与上述蛋白数据库进行blastx比对，发现共有36，032个Unigene可被比对到CDS中，其中1000bp以上的序列有6136条，占17％。
　　4、基因表达谱差异分析发现，白花紫枝与粉花紫枝有431个All-Unigene存在差异（FDR＜0.001且|log2Ratio|≥1），红花紫枝与粉花紫枝有1319个All-Unigene存在差异，红花紫枝与白花紫枝共有1324个All-Unigene存在差异。
　　5、基于构建的紫枝玫瑰花瓣转录组数据库，结合基因表达谱分析，用DEGs法筛选出了5个与玫瑰花色形成相关的关键酶基因，涉及到编码苯丙氨酸代谢途径、类黄酮合成途径和花青苷合成途径，分别是Unigene23269（编码4-香豆酰-辅酶A连接酶，Rr4CL），CL4955（编码查耳酮合酶，RrCHS），Unigene6173（编码查耳酮-二氢黄酮异构酶，RrCHI），Unigene1729（编码二氢黄酮醇还原酶，RrDFR），CL1274(编码尿苷二磷酸-葡萄糖基转移酶基因，RrUGT).
　　6、采用实时荧光定量PCR技术，研究所筛选出的5个与玫瑰花色形成有关的基因在不同花发育时期的表达模式，并结合HPLC检测数据进行综合分析，结果表明:花蕾期，Rr4CL基因在粉花紫枝中的表达量相对高于其它两个品种，而粉花紫枝花蕾期山奈酚衍生物的含量高于其它两个品种，推测其与玫瑰的粉色花形成有关;RrDFR基因在3个玫瑰品种不同花发育时期的表达具有明显的特异性。花蕾期，RrDFR基因在粉花紫枝和红花紫枝中的表达水平均很高，而在白花紫枝中的表达水平仅为红花紫枝的2.01％;半开期，RrDFR基因在三个玫瑰品种中的表达水平迅速降低，在红花紫枝中，该基因的表达水平仅为花蕾期的0.18％，在粉花紫枝中，该基因的表达水平只有花蕾期的41.85％;盛开期，RrDFR基因在红花紫枝中的表达水平仅为花蕾期的0.46％，在粉花紫枝中的表达水平为花蕾期的3.64％;衰老期，RrDFR基因在红花紫枝中的表达水平仅为花蕾期的0.15％，在粉花紫枝中的表达水平为花蕾期的0.22％; RrDFR基因在白花紫枝中的表达水平在四个时期均极低，花蕾期的表达水平略高于其它时期，说明花青苷可能在花蕾期就已经完成了积累，而RrDFR基因的低表达量可能是白花紫枝玫瑰呈色的原因。

目录

摘要

第一章 文献综述

1 玫瑰概述

2 高效液相色谱技术(HPLC)概述

3 玫瑰花色研究

3．1 花色素的构成

3．2 玫瑰花色合成途径中及相关结构基因

4 转录组研究概述

4．1 转录组测序发展背景

4．2 测序技术的发展

4．3 第三代测序技术的发展

4．4 高通量测序技术在植物研究中的应用

4．5 数字基因表达谱技术

5 有关代谢途径的认知

6 研究目的、内容和技术路线

6．1 研究的目的和意义

6．2 主要研究内容

6．3 研究技术路线

第二章 紫枝玫瑰及其花色变异品种花色素成分的定性和定量分析

1 材料与方法

1．1 试验材料与试剂

2 花色素成分的定性定量分析及鉴定

3 结果与分析

3．1 紫枝玫瑰及其花色变异品种花色素成分的定性定量分析

4 讨论

第三章 紫枝玫瑰及其花色变异品种的转录组测序与基因表达谱分析

1 试验材料

2 试验方法

2．1 RNA-Seq生物信息学分析

2．2 Unigene功能注释

2．3 显著差异表达基因的筛选

3 结果与分析

3．1 转录组样品测序质量评估

3．2 Trinity组装

3．3 Unigene功能注释

3．4 unigene的代谢通路分析

3．5 编码蛋白框(CDS)预测

3．6 显著差异表达基因的分布与筛选

3．7 花色相关显著差异表达基因的通路分析

4 讨论

第四章 紫枝玫瑰花色素成分生物合成关键基因的表达分析

1 材料与方法

1．1 试验材料

1．2 试验方法

2 结果与分析

3 结论与讨论

参考文献

致谢

攻读学位期间发表的学术论文

声明

附录