玉米紫色叶鞘基因的定位及其候选基因预测

摘要

色素的沉积、分布和浓淡在各种玉米间的变化对玉米功能基因组研究、遗传育种应用等方面具有重要价值。紫色叶鞘(purple leaf sheath，PSH)是玉米中比较常见的与色素相关的性状。它是指导玉米育种的重要形态标记，利用它可以更加直观的对关联的特殊性状进行选择和遗传研究。已有研究证明玉米紫色植株花色苷色素具有延缓衰老的功能。另外随着对紫色叶鞘的深入研究，可以进一步完善色素合成的生理机制。因此，开展玉米紫色叶鞘基因的定位具有十分重要的理论意义和实用价值。
　　本研究利用玉米自交系DH1M和T877杂交构建的F2群体和包含208个系的重组自交系群体为材料，对紫色叶鞘性状进行遗传分析和基因定位。主要结果如下:
　　(1)F2群体出现了紫色叶鞘与绿色叶鞘的分离，并且紫色叶鞘植株与绿色叶鞘植株的分离比符合3∶1的孟德尔分离比。此外，在RIL群体中紫色叶鞘家系与绿色叶鞘家系的分离比符合1∶1，这说明紫色叶鞘由一个显性核基因PSH控制。
　　(2)利用WinQTLCart软件对RIL群体进行基因定位，初步将PSH定位在10号染色体。同时利用基因芯片对亲本和190株F2单株进行SNP分型，初步将PSH定位在10号染色体的SNP标记SYN17666附近，并将该SNP转化成CAPS标记进行验证。然后通过QTL-seq技术快速定位PSH。首先利用高通量测序对两个亲本池及30个绿色叶鞘家系组成的隐性池进行了全基因组测序。然后对测序结果进行了过滤、比对、SNP-index计算和作图。结果发现在10号染色体128M-132M及134M-139M两个区域内SNP-index值大于0.9，因此，进一步推断控制紫色叶鞘的基因在10号染色体128-139Mb区域内。与此同时，利用MaizeGDB上公布的标记对98株F2单株和76个RIL进行基因分型，将PSH基因定位在标记IDP8334和IDP7541之间大约2Mb区间内。研究表明QTL-seq结果与本研究运用传统基因定位方法得到的定位结果一致，两者起到了相互验证的作用。在此基础上，利用重测序信息开发新的Indel标记进一步缩小定位区间至标记Indel02A和Indel01C之间大约304Kb区间内。
　　(3)通过基因注释发现上述304 Kb范围内含有10个基因，其中基因5(GRMZM5 G822829)注释编码bHLH转录因子，它是花青素合成通路中一种重要的调控因子。基因5的同源基因在水稻与拟南芥中也都编码假定的bHLH型调控因子。另外，序列分析发现基因5在双亲间存在4处序列差异。因此，本研究将该基因作为紫色叶鞘基因最可能的候选基因。然后，利用Real-Time PCR技术对基因GRMZM5G822829进行表达量分析，表明该基因在紫色叶鞘和绿色叶鞘亲本间的表达量存在极显著差异，进一步证明了GRMZM5G822829是紫色叶鞘基因PSH的候选基因。这为目的基因的克隆及功能验证奠定了基础。

目录

摘要

1 前言

1．1 植株花青素的研究进展

1．1．1 花青素合成途径

1．1．2 花青素合成途径中重要基因的研究进展

1．1．3 环境因子

1．2 图位克隆和分子标记

1．2．1 图位克隆原理

1．2．2 分子标记

1．3 混合分组分析(BSA)法与QTL-seq

1．4 本研究的目的与意义

2 材料与方法

2．1 群体材料

2．2 常用分子生物学试剂

2．3 表型鉴定

2．4 玉米基因组DNA提取

2．5 PCR反应体系和程序

2．6 聚丙烯酰胺凝胶电泳

2．7 分子标记开发

2．7．1 CAPS标记

2．7．2 InDel标记

2．8 基因定位

2．8．1 初步定位

2．8．2 利用QTL-seq技术快速定位目的基因

2．8．3 利用图位克隆法对基因进行精细定位

2．9 候选基因预测和分析

2．10 总RNA提取、第一链cDNA合成和Real-Time PCR分析

2．10．1 总RNA提取

2．10．2 第一链cDNA合成

2．10．3 Real-Time PCR分析

3 结果与分析

3．1 玉米F2群体的表型特征

3．2 玉米紫色叶鞘性状的遗传分析

3．3 紫色叶鞘基因的定位

3．3．1 紫色叶鞘基因初步定位

3．3．2 利用QTL-seq技术快速定位

3．3．3 紫色叶鞘基因精细定位

3．4 候选基因预测和分析

3．4．1 候选基因预测

3．4．2 候选基因(GRMZM5G822829)的序列分析

3．4．3 候选基因(GRMZM5G822829)的组织特异性表达分析

3．4．4 候选基因(GRMZM5G822829)蛋白结构与功能的预测

4 小结与讨论

结论与展望

参考文献

附录

致谢

攻读学位期间发表的学术论文目录

声明