PRV和PCV2混合感染致病特点及猪伪狂犬病防控技术研究

摘要

猪伪狂犬病毒(pseudorabies virus，PRV)和猪圆环病毒2型(porcine circovirus type2，PCV2)都能使猪发病和产生免疫抑制，二者混合感染引起发病猪病情加重及猪场重大经济损失，但二者混合感染导致机体损伤及致病的机理还不清楚。深入研究猪圆环病毒2型胁迫下猪伪狂犬病防控机制，能为种猪场猪伪狂犬病净化提供理论支持。本试验通过人工单独和混合感染PRV和PCV2，通过分离病毒、荧光定量PCR以及血液生理生化指标和血清感染抗体的测定，研究PRV和PCV2混合感染的致病机制;并对云南省72家规模猪场进行了猪伪狂犬病净化综合防控技术的研究。
　　1.PRV和PCV2混合感染仔猪的临床病理学研究
　　PRV和PCV2都是猪的重要传染病。PRV可以引起猪的繁殖障碍及呼吸道疾病;PCV2引起猪的断奶后多系统消耗综合征、繁殖障碍、皮炎与肾病综合征及呼吸道病综合征等多种疾病。本实验通过人工单独感染PRV、单独感染PCV2、混合感染PRV和PCV2，对感染仔猪后出现的临床症状、病理变化进行观察。结果表明:混合感染PRV和PCV2的仔猪出现的病理症状比单独感染病毒产生的症状严重。PRV单独感染仔猪表现为特有的“发热-神经症状-奇痒-呕吐（腹泻）”症状;PCV2单独感染仔猪表现为“发热-呼吸困难-消瘦-贫血”等多系统功能衰竭综合症;而PRV和PCV2混合感染仔猪表现为“发热-消瘦-神经衰竭-呕吐-死亡”等特征性临床症状;单独感染PRV或PCV2组的仔猪没有出现死亡，而混合感染PRV和PCV2组的仔猪在感染后第14d全部死亡。显微观察可见，攻毒后第3d-35d，感染仔猪的心、肝、脾、肺、肾、淋巴结和小脑均出现明显的显微病理变化。混合感染仔猪的组织病理变化要比单感染PRV或PCV2的病变严重，单感染PRV比单独感染PCV2仔猪的显微病理变化严重，对照组无病理变化。
　　2.人工感染PRV和PCV2仔猪组织器官病毒载量消长规律研究
　　通过实时荧光定量PCR方法，对单独感染PRV或PCV2组，混合感染PRV和PCV2组，在攻毒后第3、7、14、21、35d，随机取2头仔猪宰杀，取心、肝、脾、肺、肾、腹股沟淋巴结、小脑7个组织器官;采集感染仔猪的血液、肛门拭子，鼻拭子进行病毒载量测定，分析样品中的带毒情况及排毒变化规律。结果:7个组织器官混合感染组的组织病毒载量比单独感染PRV组或PCV2组高，PRV的载量比PCV2高;病毒载量由高到低依次为肺脏、腹股沟淋巴结、肝脏、脾脏、肾脏、小脑、心脏。其中混合感染组PRV病毒载量在第14d最高，单独感染PRV组的病毒载量在第7天最高;单独感染PCV2组的病毒载量在第14天最高;结合感染猪的病理变化分析表明，病毒载量越高仔猪表现临床症状越明显，组织器官损伤越严重。混合感染组的病毒载量最高，发病最严重并出现仔猪死亡，组织器官严重损伤。对感染组仔猪的血液、肛门拭子、鼻拭子中的载毒量测定发现，混合感染组和PRV单独感染组的载毒量在感染后第7d-14d处于较高水平;而PRV单独感染组在感染中后期持续排毒;PCV2单独感染组的血液中病毒载量最高、出现病毒的时间最早，但是感染后期排毒水平较低，可见PCV2感染是在感染早中期对外排毒严重，感染后期对外排毒减少。
　　3.PRV和PCV2混合感染对仔猪免疫抑制影响的研究
　　采集感染病毒仔猪血液，应用ELISA方法检测血清中IL-4、IL-6、IL-10和IFN-γ四种细胞因子、补体C3、C4、IgG的含量和红细胞、血红蛋白、白细胞、淋巴细胞、中性细胞及血小板的数量。结果:与单独感染PRV或PCV2组比较，混合感染PRV和PCV2组的IL-4、IL-10和IFN-γ效价在感染后第3-14d呈上升趋势，并都高于2个单独感染组;IL-6在第0-3d快速下降，低于单独感染PRV组;表明在感染早期混合感染组仔猪的体液和细胞免疫都参与了抗病毒的反应。混合感染组的C3效价在第0-3d上升，第7-21d下降，并明显低于2个单独感染组; C4效价呈上升趋势，但明显低于2个单独感染组的C4效价。混合感染组的免疫球蛋白IgG含量在0-14d均低于2个单独感染组，说明混合感染组的仔猪在感染前期，其免疫系统就已受到抑制。混合感染组的红细胞、血红蛋白、中性粒细胞数量均高于单独感染PCV2组和PRV组;感染仔猪的血清抗体检测结果发现，混合感染PRV和PCV2组中，抗PRV的抗体显著低于单独感染PRV组，抗PCV2抗体与单独感染PCV2的抗PCV2抗体无差异性。以上结果表明，混合感染造成的免疫抑制比单独感染组的严重。
　　4.PRV和PCV2混合感染猪伪狂犬病防控技术研究及示范
　　近年来云南省猪伪狂犬病居高不下，为优化猪伪狂犬病的防控技术，本试验选择规模适中的3个PRV、PCV2感染阳性的种猪场，设计了三种净化方案，即A场:检测净化PRV、PCV2感染抗体阳性猪，免疫猪伪狂犬基因缺失疫苗;B场:检测净化猪伪狂犬感染抗体阳性猪，免疫PRV基因缺失疫苗;C场:检测净化PRV和PCV2感染抗体阳性猪，同时免疫PRV基因缺失和PCV2疫苗，并分析这三种防控方法的猪场净化绩效。结果表明，三种净化方法均能控制猪场猪伪狂犬病，C场净化2种病毒，同时接种2种疫苗情况下净化效果最好。在此基础上，研究制订了猪伪狂犬病净化技术规程，2012-2015年在云南省72家规模猪场和1个示范县进行示范，并用ELISA方法检测感染抗体7516份和免疫抗体8696份。结果显示:2012年、2013年、2014年、2015年猪伪狂犬病野毒感染率分别是24.42％、5.47％、2.78％、2.69％;其中种公猪感染率分别为18.25％、12.36％、8.33％、3.15％;种母猪的感染率分别为24.73％、4.80％、2.48％、2.65％;免疫抗体阳性率分别为69.03％、81.86％、85.99％、86.40％，有14户野毒感染率0％。结果表明，经过4年净化，猪场猪伪狂犬病毒的野毒感染率呈逐年降低趋势，免疫抗体阳性率逐年升高，说明猪伪狂犬病净化技术规程在云南省大部分地区具有实用性和操作性，可以推广应用。

目录

符号说明

摘要

第一章 文献综述一猪伪狂犬病研究进展

1．PR病原学概述

1．1 PRV的形态结构

1．2 PRV的理化特性

1．3 PRV主要特征

1．4 PRV的生物学特性

1．5 PRV培养特性

1．6 PRV致病机理

2．PR流行病学

2．1 PR的流行动态

2．2 我国猪伪狂犬的流行动态

2．3 猪伪狂犬病流行新特点

2．4 PR临床症状

2．5 病理变化特征

2．6 云南省猪伪狂犬的流行动态

3．PR检测方法研究进展

3．1 血清学检测方法

3．2 分子生物学检测

3．3 病毒分离(Ⅵ)与动物接种试验

3．4 HE染色镜检及免疫组化检测方法的建立

3．5 免疫荧光标记检测

3．6 鉴别诊断

参考文献

第二章 文献综述二PRV和PCV2混合感染猪伪狂犬病防控研究进展

1．PRV、PCV2对养猪业生物安全影响

2．PRV和PCV2混合感染的危害

3．PR防控研究进展

3．1 国外PR防控研究

3．2 我国PR的防控研究

4．PRV和PCV2混合感染猪伪狂犬病综合防控机制

参考文献

第三章 PRV和PCV2的血清流行病学调查和混合感染仔猪病理学特征研究

1．材料与方法

1．1 材料来源

1．2 病毒来源

1．3 试验试剂

1．4 主要仪器设备

1．5 试验方法

1．6 结果判定

2．结果

2．1 血清流行病学调查结果

2．2 体温变化规律比较

2．3 临床症状观察结果

2．4 大体剖解病理变化

2．5 H．E染色显微镜病理变化结果

3．讨论

4．小结

参考文献

第四章 PRV和PCV2混合感染仔猪组织器官病毒消长及排毒规律研究

1 材料和方法

1．1 材料来源

1．2 病毒来源

1．3 主要试剂

1．4 实验设备及材料

1．5 实验方法

2 结果与分析

2．1 攻毒试验前四种病原PCR检测结果

2．2 感染仔猪内脏器官病毒载量变化规律

2．3 感染仔猪肝脏病毒载量变化规律

2．4 感染仔猪脾脏病毒载量变化规律

2．5 感染仔猪肺脏组织病毒载量变化规律

2．6 感染仔猪肾脏病毒载量变化规律

2．7 感染仔猪腹股沟淋巴结病毒载量变化规律

2．8 感染仔猪小脑病毒载量变化规律

2．9 不同时期、各组织器官病毒载量变化规律比较

2．10 单感染和混合感染病毒载量变化规律比较

2．11 感染仔猪血液中PRV、PCV2病毒载量变化规律

2．12 感染仔猪鼻拭PRV、POV2病毒载量变化规律

2．13 感染仔猪肛门拭子PRV、PCV2病毒载量变化规律

3．讨论

4．小结

参考文献

第五章 PRV和PCV2混合感染对仔猪免疫抑制影响的研究

1 材料与方法

1．1 材料来源

1．2 实验分组及样品采集

1．3 试剂和仪器

1．4 方法

1．5 细胞因子数据处理

1．6 ELISA抗体试验方法步骤

2．结果

2．1 细胞因子检测结果

2．2 补体测定结果

2．3 免疫球蛋白IgG

2．4 血细胞数量变化规律

2．5 PRV感染抗体检测结果

2．6 PCV2感染抗体检测结果

3．讨论

4．小结

参考文献

第六章 PRV和PCV2混合感染猪伪狂犬病防控技术研究及示范

1．材料与方法

1．1 实验材料

1．2 实验方法

1．3 模式猪场的要求与选择

1．4 示范猪场的要求与选择

2．结果

2．1 模式猪场净化前后检测结果

2．2 示范猪场猪伪狂犬病净化效

3 讨论

4．小结

参考文献

全文总结

致谢

攻读博士学位期间取得的成果

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