猪源BVDV-2非结构蛋白Npro的原核表达及其对猪PBMCs和相关细胞因子的影响

摘要

牛病毒性腹泻病毒（Bovine Viral Diarrhea Virus，BVDV）是牛病毒性腹泻(牛病毒性腹泻-黏膜病，BVD-MD)的病原体，为正链RNA病毒，全基因组长约12.3 kb，归类于黄病毒科瘟病毒属。根据BVDV基因组分析的遗传特征，其可分为基因1型(BVDV-1)和基因2型(BVDV-2)。先前的流行病学调查显示BVDV-1的流行区域更为广泛，然而，近年来国内BVDV-2的发病率呈持续升高趋势。BVDV的宿主谱广，除了可以引起牛的病毒性腹泻以外，猪、山羊、绵羊、鹿和野生反刍动物等其他动物也可感染，值得警惕的是，近年来猪感染BVDV的情况日趋增多。研究报道，BVDV的非结构蛋白Npro在抗病毒反应中发挥重要作用，可以协助病毒逃逸宿主的先天免疫反应。基于非结构蛋白Npro在BVDV病原学上的重要功能和致病性，在本实验室前期的研究中，对猪源BVDV-2病原性作了相关探索，在细胞水平上初步探析了猪源BVDV-2非结构蛋白Npro的功能，为深入研究该蛋白对动物机体免疫功能的影响及其致病性的分子机制奠定了基础。本研究旨在探究猪源BVDV-2非结构蛋白Npro对于猪免疫功能的影响，初步了解其在BVDV感染猪体的分子机制发挥的作用，为猪源BVDV的预警和防控提供一定理论基础。
　　本研究主要分以下3个部分:
　　研究一:猪源BVDV-2非结构蛋白Npro的原核表达。为了保证后续仔猪攻毒实验的顺利进行，我们诱导表达了猪源BVDV-2分离株SH-28的非结构蛋白Npro并制各其多抗血清。将猪源BVDV-2分离株SH-28在MDBK细胞上增殖培养，再从细胞中提取总RNA。采用反转录酶-聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增Npro基因片段，并将其克隆至pMD19-Tsimple vector，从而获得重组质粒pMD19-T-Npro。然后，将目的片段插入pET-28a(+)中，构建了以E.coli BL21(DE3)为宿主菌的原核表达系统。SDS-PAGE电泳证实了约26 KDa的包涵体重组蛋白Npro成功表达。BCA法测定纯化的重组蛋白其浓度为1.23 mg/mL。然后通过用纯化的Npro重组蛋白三次免疫小鼠，来制备多克隆抗体血清，间接ELISA方法测定其滴度为1∶12800。Western biot证实Npro多抗血清能与纯化的Npro重组蛋白发生特异性反应。说明我们成功制备了Npro蛋白的多抗血清，可用于后续实验。
　　研究二:猪源BVDV-2非结构蛋白Npro对猪外周血细胞的影响。为探究猪源BVDV-2非结构蛋白Npro对猪外周血免疫细胞的影响，本实验用4 mL(107 TCID50/0.1 mL)猪源BVDV-2分离株SH-28及4mL(107 TCID50/0.1 mL)缺失株vASH△Npro分别感染无BVDV和猪瘟病毒(Classical Swine Fever Virus，CSFV)病原的30日龄断奶仔猪，对照组肌注4mL DMEM培养基。采集感染组猪的血液，进行病毒分离鉴定，验证猪源BVDV-2是否成功感染猪。结果显示，从两组感染猪体内分离到的病毒SH-28/p和vASH△Npro/p均能与针对BVDV E2蛋白的单克隆抗体Bz-53发生特异性反应;但Npro的多克隆抗体只能识别SH-28/p，而vASH△Nprop不能和Npro多克隆抗体发生特异性反应，证实猪源BVDV-2分离株及其缺失株均感染猪成功，并能从猪体分离到病毒。每天观察、记录实验猪只的临床表征并打分、体温变化，结果显示:SH-28感染组猪的临床表征分值在第1～14 day post-infection(dpi)呈逐渐升高的趋势，之后开始下降。而缺失株感染组在攻毒后10天内临床表征不明显，到第16 dpi时临床表征分值达到最高，之后开始好转;感染后期，两个感染组的临床分值均显著高于对照组差异显著（P＜0.01）。分离株SH-28感染组猪的体温从第3～10 dpi呈逐渐上升趋势，第10 dpi体温最高，且达到41.5℃左右;而缺失株感染组在攻毒后8天内体温变化不明显，到第12 dpi时体温达到最高，约40.5℃;在感染中期，两个感染组均极显著高于对照组(P＜0.01）。两个感染组猪体温在感染后期均恢复正常。
　　进一步采用血液常规术检测感染后实验猪外周血中白细胞、红细胞、血小板的变化，结果表明:三个实验组的猪外周血中白细胞数量均在6 dpi后开始出现大幅度波动，在第18 dpi、20 dpi分离株SH-28感染组极显著低于缺失株vASH△Npro感染(P＜0.01）;三个实验组的红细胞数量在整个感染周期中均无显著差异;在感染的前、中期，血小板数量变化的波动幅度很大，从第12 dpi开始出现分离株SH-28感染组极显著低于缺失株vASH△Npro感染组(P＜0.01)。CD4T和CD8T细胞是免疫反应中的两个重要指标，进而利用流式细胞术测定猪外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)这两个T淋巴细胞亚群的变化，结果显示:在感染的中、后期，缺失株vASH△Npro感染组猪PBMCs中CD4T细胞的比例显著高于其他两组（P＜0.05）;缺失株vASH△Npro感染组猪PBMCs中CD8T细胞的比例极显著高于其他两组（P＜0.01）。
　　综上，本试验说明了感染猪源BVDV-2可引起猪体内白细胞和血小板的下降，而Npro蛋白的缺失可使白细胞数量回升，初步证实了Npro蛋白的缺失可减弱猪源BVDV-2的致病性。此外，Npro蛋白的缺失还可引起CD8T细胞和CD4T细胞的比例上升，提高了猪体内的免疫反应。这为猪源BVDV-2的致病机理及其免疫机制的探究提供了重要线索。
　　研究三:猪源BVDV-2非结构蛋白Npro对猪PBMCs产生细胞因子的影响。为了探究猪源BVDV-2非结构蛋白Npro对细胞因子介导的抗病毒免疫机制，本实验通过利用实时荧光定量PCR(Real-time quantitative PCR，qRT-PCR)检测SH-28和缺失株vASH△Npro感染猪PBMCs中7种细胞因子(IL-1β、IL-8、IL-10、1FN-α、OAS、Mxl、PKR) mRNA的转录水平，从而阐明Npro蛋白对宿主抗病毒免疫的调节机制，进一步揭示其在猪源BVDV-2感染猪体过程中所发挥的作用。IL-1β和IL-8的转录水平结果显示:两个感染组的转录水平都有先上升后降低的趋势，并在感染中期，出现分离株SH-28感染组极显著高于其他两组(P＜0.01）。IL-10的转录水平结果显示:虽然，两个感染组猪体内的IL-10均呈现下降趋势，但在感染前期、中期，出现缺失株vASH△Npro感染组极显著高于其他两组的情况（P＜0.01）。进一步检测猪体内干扰素及其下游抗病毒因子的表达，发现猪感染BVDV后，两个感染组猪体内IFN-α、OAS和Mxl的表达均呈下降趋势，但其表达量仍高于对照组(P＜0.05)，尤其是OAS，且缺失株感染组显著高于SH-28感染组(P＜0.01）。此外，虽然SH-28感染组和缺失株感染组PKR的表达量在感染的前、中期均极显著高于对照组(P＜0.01)，但两者之间并没有呈现较为规律的差异性。
　　综上，本试验证实了猪源BVDV-2非结构蛋白Npro对猪PBMCs中细胞因子有一定影响，进一步揭示了Npro蛋白在宿主抗病毒免疫中的重要性。

目录

摘要

符号说明

文献综述

一．猪源基因2型牛病毒性腹泻病毒的研究进展

1．猪源BVDV的流行情况

2．猪源BVDV的来源

3．猪源BVDV感染的临床表征

4．猪源BVDV的检测与鉴定

二．非结构蛋白Npro与外周血单个核细胞的研究进展

1．非结构蛋白Npro的研究进展

2．外周血单个核细胞及其相关细胞因子的抗病毒研究进展

三．研究的目的及意义

参考文献

第一部分 猪源BVDV-2非结构蛋白Npro的原核表达

1．材料

1．1 毒株、细胞、菌株和载体

1．2 主要试剂

1．3 主要仪器设备

1．4 实验动物

2．方法

2．1 引物设计

2．2 PCR模板的制备

2．3 PCR扩增体系与反应条件

2．4 pMD19-T-Npro重组质粒的构建

2．5 pET-28a-Npro重组质粒的构建与鉴定

2．6 Npro蛋白的表达与鉴定

2．7 重组蛋白的大量诱导表达与纯化

2．8 重组蛋白多抗血清的制备与鉴定

3．结果

3．1 PCR扩增Npro基因

3．2 重组质粒pMD19-T-Npro的测序鉴定

3．3 重组质粒pET-28a-Npro的PCR鉴定

3．4 融合蛋白诱导表达及纯化

3．5 多克隆抗体的鉴定

4．讨论

参考文献

第二部分 猪源BVDV-2非结构蛋白Npro对猪外周血细胞的影响

1．材料

1．1 毒株、细胞

1．2 主要试剂

1．3 主要仪器设备

1．4 实验动物

2．方法

2．1 实验动物分组

2．2 体温测定和临床打分系统

2．3 采集样品

2．4 病毒分离

2．5 间接免疫荧光检测

2．6 Western blot鉴定

2．7 猪PBMCs的分离

2．8 流式细胞仪检测T细胞亚群

2．9 引物设计

2．10 PCR模板的制备

2．11 PCR扩增体系与反应条件

2．12 数据处理

3．结果

3．1 RT-PCR检测

3．2 间接免疫荧光检测

3．3 Western blot鉴定

3．4 感染BVDV猪体的临床表征

3．5 实验猪的血常规检测结果

3．6 流式细胞术检测感染猪体内T细胞亚群的变化

4．讨论

参考文献

第三部分 猪源BVDV-2非结构蛋白Npro对猪PBMCs产生细胞因子的影响

1．材料

1．1 实验动物

1．2 毒株

1．3 主要试剂

1．4 主要仪器设备

2．方法

2．1 实时荧光定量PCR引物设计

2．2 实时荧光定量PCR实验

2．3 实验动物分组

2．4 统计学分析

3．结果

3．1 BⅥ)V感染对猪体内IL-1β转录水平的影响

3．2 BVDV感染对猪体内IL-8转录水平的影响

3．3 BVDV感染对猪体内IL-10转录水平的影响

3．4 BVDV感染对猪体内IFN-α转录水平的影响

3．5 BVDV感染对猪体内OAS转录水平的影响

3．6 BVDV感染对猪体内Mx1转录水平的影响

3．7 BVDV感染对猪体内PKR转录水平的影响

4．讨论

参考文献

全文小结

攻读学位期间发表的学术论文

致谢

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