禽传染性喉气管炎病毒gJ蛋白的原核表达及单克隆抗体的研制与标准抗原抗体的制备

摘要

传染性喉气管炎(Infectious Laryngotracheitis，ILT)是由疱疹病毒科传染性喉气管炎病毒(Infectious Laryngotracheitis virus，ILTV)引起的鸡的一种呼吸道传染病。主要临床症状为咳出含有血液的渗出物并伴发高死亡率，引起流鼻涕、结膜炎、体重和产蛋下降。本病自1925年首次报道以来，现已遍布各养禽国家和地区，我国主要呈地方流行。本研究利用原核表达系统成功表达重组蛋白His-gJ，并研制了3株针对ILTV gJ蛋白的单克隆抗体。同时以ILTV王岗(WG)株免疫SPF鸡制得多抗血清，对ILTV抗原和抗血清进行一系列标定，获得了ILTV的标准抗原和标准血清，为ILTV的诊断和防治提供了有效的方法和材料。
　　1、抗禽传染性喉气管炎病毒gJ蛋白原核表达与单克隆抗体的研制
　　根据GenBank中已发表的传染性喉气管炎病毒gJ全基因序列设计gJ编码区(445-745位氨基酸)的特异性引物，上下游引物分别引入酶切位点BamHⅠ和XhoⅠ，以传染性喉气管炎病毒WG株基因组为模板进行PCR扩增，扩增产物克隆并连接到原核表达载体pET-32a(+)中，构建重组质粒pET-32a-gJ并转化到BL21(DE3)。经IPTG诱导后，获得大小为55KD的重组蛋白His-gJ。并利用亲和柱对重组蛋白His-gJ进行纯化，SDS-PAGE和Western-Blot结果表明，融合蛋白His-gJ具有良好的抗原性;利用获得的ILTV重组蛋白His-gJ为抗原，建立检测ILTV抗体的ELISA方法。
　　以ILTV WG株全病毒作为免疫原，按照常规程序免疫6-8周龄Balb/c小鼠，取脾细胞与S/P20细胞融合，利用重组蛋白His-gJ进行间接酶联免疫吸附实验(ELISA)筛选阳性细胞株，最终得到3株分泌针对ILTV gJ蛋白单克隆抗体的阳性细胞株，分别命名为:ILTV-gJ-4C6、ILTV-gJ-5B8、ILTV-gJ-6B6。Western-Blot与间接免疫荧光(IFA)鉴定结果表明，所得三株单抗均能与ILTV WG株天然病毒发生特异性反应。3株单克隆抗体的抗体亚类均为IgG1，Kappa链。利用亲和层系技术分别纯化了3株单抗腹水，获得了高纯度的单克隆抗体，为今后建立ILTV检测技术提供了良好的试剂材料。
　　2、禽传染性喉气管炎病毒标准抗原及血清的制备
　　本研究用SPF鸡胚扩增禽传染性喉气管炎病毒WG株，对收集的传染性喉气管炎病毒进行了病毒含量测定分析，结果该材料中病毒为10-4.9ELD50/0.2mL。血凝试验(HA)、聚合酶链式反应(PCR)及ELISA实验技术进一步鉴定了该病毒无传染性法氏囊病毒(IBDV)、传染性支气管炎病毒(IBV)、小鹅瘟病毒(GPV)、马立克氏病病毒(MDV)、禽流感病毒(AIV)、新城疫病毒(NDV)、鸡产蛋下降综合症(EDS-76)、禽白血病病毒(ALV)等外源性病毒污染，无菌检验也证明该病毒材料无菌生长、无支原体污染。将该ILTV全病毒抗原经一系列标定，加入1％BSA冻存保护剂，分装，冻干，并进行物理性状和无菌检验及支原体污染检验，最后获得了ILTV的标准抗原。
　　将ILTV WG株多次免疫SPF鸡，制得了抗ILTV多抗血清，用重组融合蛋白gJ进行间接ELISA检测，结果表明该血清的ELISA效价为1∶1200。利用HI、IFA实验技术鉴定该多抗血清抗体，证明该血清与上述其他病毒多抗血清无交叉反应性，仅与ILTV反应，特异性良好;无菌检验、支原体检验合格。经一系列标定后，在血清中加入万分之一的硫柳汞防腐剂，分装，冻干，并进行物理性状的检查以及均一性、稳定性、长期保存性的鉴定，最终获得了高质量的标准血清。通过标定阳性及弱阳性血清，对目前市场上常用的商品化检测ILTV抗体的ELISA试剂盒可靠性进行了测定，证明所试两种商品化ELISA试剂盒可用于临床样品检测。

目录

摘要

符号说明

文献综述

1 病原学

1．1 病毒分类及基本结构

1．2 理化特性

1．3 生物学特性

1．4 病毒基因组结构

1．5 病毒复制

2 流行病学

3 临床症状及病理学变化

4 诊断

4．1 组织学检查

4．2 电镜检查

4．3 病毒分离

4．4 免疫荧光试验

4．5 琼脂扩散试验

4．6 酶联免疫吸附试验(ELISA)

4．7 病毒中和试验

4．8 聚合酶链式反应(PCR)

5 防制

6 兽用生物制品国家标准物质的研究现状

6．1 OIE传染性喉气管炎病毒检测技术标准

6．2 标准物质的作用

6．3 我国兽用标准物质现状

研究内容一 禽传染性喉气管炎病毒gJ蛋白表达与单克隆抗体的研制

1 材料

1．1 生物材料

1．2 试剂与载体

2 方法

2．1 ILTV gJ蛋白的原核表达

2．2 抗ILTV gJ单克隆抗体的制备

2．3 检测ILTV抗体间接ELISA方法的初步建立

3 结果

3．1 gJ蛋白的表达

3．2 抗ILTV gJ单克隆抗体的制备

3．3 检测ILTV抗体间接ELISA方法的初步建立

4 小结和讨论

研究内容二 禽传染性喉气管炎病毒标准抗原及抗体的制备

1 材料

1．1 生物材料

1．2 主要仪器和试剂

2 方法

2．1 ILTV标准抗原的制备

2．2 ILTV多抗血清的制备

2．3 禽传染性喉气管炎病毒标准物质的标定

3 结果

3．1 ILTV标准抗原的制备

3．2 禽传染性喉气管炎病毒标准物质的标定

4 小结和讨论

全文总结

参考文献

致谢

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