两种药剂刺激灰飞虱和褐飞虱生殖的生理生化及分子机制研究

摘要

灰飞虱和褐飞虱（属半翅目、飞虱科）是水稻的重要害虫，除直接刺吸为害造成损失外，灰飞虱还传播水稻条纹叶枯和水稻黑条矮缩等病毒，造成水稻产量严重损失。三唑磷是一种典型引起害虫再猖獗现象的杀虫剂。井冈霉素是防治水稻纹枯病的抗生素类杀菌剂，由于毒性低，残留低，成本低等特点，很容易被滥用。目前已发现井冈霉素喷雾处理和点滴处理均能刺激褐飞虱生殖。因此本文以灰飞虱和褐飞虱为研究对象，以阐明这两种飞虱受农药处理后生殖机制的变化。
　　1、三唑磷处理后灰飞虱蛋白质组学分析
　　为了研究三唑磷处理后对灰飞虱生殖的影响及灰飞虱再猖獗机制，利用iTRAQ技术对三唑磷处理后灰飞虱进行了蛋白组学分析，共鉴定到6198个蛋白质，其中差异蛋白有217个（上调56个，下调161个）。本次分析共得到118条pathway，表中共列出18条与生殖有关的pathway。通过pathway注释与富集分析，筛选出三唑磷处理显著上调的长链脂肪酸辅酶A连接酶(FACL)进行RNAi以进一步证实该基因在药剂刺激生殖中的作用。
　　2、干扰长链脂肪酸辅酶A连接酶FACL对灰飞虱生殖的影响
　　先对灰飞虱FACL基因进行克隆，得到全长序列。接着利用饲喂法对三唑磷(TZP)喷雾处理的灰飞虱进行RNA干扰，形成干扰处理TZP+dsFACL，随后进行iRNA干扰实验，结果显示取食含有dsFACL人工饲料的灰飞虱的生殖力显著下降，灰飞虱产卵量下降73.9％，产卵历期减少8.9天，雌虫寿命减少7.9天。生理生化测定结果表明，dsFACL处理后体内蛋白质下降4.7％，甘油下降19.9％及体重下降13.6％，因此我们认为FACL是三唑磷刺激灰飞虱生殖的重要相关基因。
　　3、井冈霉素处理后的褐飞虱卵母细胞发育的变化
　　过去药剂刺激褐飞虱生殖有许多报道，但药剂处理对卵母细胞生长和发育的影响不清楚。因此，本研究通过透射电子显微镜(TEM)观察卵母细胞变化和激素水平(保幼激素(JH)和20-羟基蜕皮激素(20E))的变化。TEM观察显示，与对照卵母细胞相比，JGM处理的卵母细胞中脂滴的大小在羽化后1天和2天分别显著减少32.6％和29.8％。JGM处理的雌虫在1和2天的JH水平分别上升了49.7％和45.7％，而20E水平分别下降了36.0％和30.0％。此外，JGM处理的雌虫体内共生菌数量在1和2天分别增加了45.9％和34.7％。我们得出结论，JGM处理影响了褐飞虱脂质代谢，这与以前的研究结果相对应。

目录

摘要

第一章 综述

2．2 农药诱导害虫再猖獗机制

3 蛋白质组学

4 RNAi的研究进展

4．1 RNAi的发现

4．2 RNAi的分子机制

4．3 RNAi技术在昆虫学中的应用

5 透射电镜在昆虫研究进展

6 研究的目的与意义

第二章 三唑磷处理后灰飞虱蛋白质组学分析

2．1 供试材料

2．2 实验方法

3 结果与分析

3．1 蛋白质鉴定

3．2 蛋白质分析

4 讨论

第三章 干扰长链脂肪酸辅酶A连接酶对灰飞虱生殖的影响

2．3 供试药剂

3 方法

3．1 药剂处理

3．2 FACL基因克隆方法

3．3 FACL的dsRNA合成

3．4 RNA干扰

3．5 实时荧光定量PCR分析

3．6 灰飞虱雌虫产卵量、产卵前期、产卵历期和寿命测定

3．7 蛋白质含量测定

3．8 体重测定

3．9 甘油含量测定

3．10 数据分析

4 结果与分析

4．1 FACL的克隆结果

4．2 实时荧光定量(qRT-PCR)

4．3 干扰FACL对灰飞虱生殖的影响

4．4 干扰FACL对灰飞虱雌虫体中蛋白质含量的影响

4．5 干扰FACL对灰飞虱雌虫体重的影响

4．6 干扰尉CZ对灰飞虱雌虫体内甘油的影响

5 讨论

第四章 透射电子显微镜观察井冈霉素处理后的褐飞虱卵母细胞发育的变化

2．1 材料

2．2 方法

2．3 数据分析

3 结果与分析

3．1 褐飞虱卵巢超微结构观察

3．2 井冈霉素处理对褐飞虱雌虫体内激素的影响

3．3 井冈霉素处理对褐飞虱雌虫体内共生菌的影响

4 讨论

参考文献

致谢

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