Rf5对HL型粳稻不育系的恢复力研究及WA型恢复基因Rf19(t)的定位

摘要

三系杂交水稻的发展为提高水稻产量作出了重大贡献。生产上的杂交稻以杂交籼稻为主，杂交籼稻主要利用野败(WA)型雄性不育细胞质，但WA型不育系育性恢复的遗传研究相对于WA型不育胞质的应用还较滞后，恢复基因资源较为狭窄，同时部分WA型不育系在外界环境影响下存在自交结实现象，这些因素直接影响杂交种的制种纯度和水稻杂种优势的利用。相较于杂交籼稻，杂交粳稻主要利用包台(BT)型细胞质雄性不育细胞质，因细胞质来源单一，产量较常规粳稻没有竞争优势而发展相对缓慢。本课题组综合考虑同核异质粳稻不育系不育性稳定性、开花习性和可恢复性，提出发展红莲(HL)型杂交粳稻的构想，并通过回交转育的方法成功转育成HL型粳稻不育系，但现有的BT型粳稻恢复系仅存在较少的HL型粳稻恢复系。因此，加强WA型恢复基因挖掘和HL型粳稻恢复基因的研究有助于三系杂交稻的进一步发展。本文以BT型粳稻恢复系泗R2982为研究材料，对其携带的HL型恢复基因进行研究，并在此基础上构建了高世代回交群体明确恢复基因对HL型粳稻不育系的恢复力，同时对一个WA型恢复基因进行定位，具体研究结果如下:
　　(1)以800株和1，200株HL-六千辛A//六千辛/泗R2982三交F2和F3单株为精细定位群体，根据交换株信息，明确BT型粳稻恢复系泗R2982中的恢复基因位于第10染色体长臂标记STS10-65和STS10-63之间，物理距离约100 kb，Rf1a(Rf5)在此区段内。BT型粳稻恢复系恢复基因来源单一，多数恢复系只携带Rf1位点，因此推测该恢复基因可能为Rf1a(Rf5)，测序结果证实这一推测。
　　(2) HL-六千辛A//六千辛/泗R2982三交群体内可育株的育性呈现连续分布，这些可育株的平均自然小穗育性明显低于HL-六千辛A/泗R2982 F1植株的育性，表明Rf5对HL-六千辛A只具有部分恢复能力，泗R2982中可能存在其他一些微效基因或修饰基因使育性恢复到完全正常。利用HL-六千辛A为轮回亲本构建HL-六千辛A//六千辛/泗R2982 BC4F2群体，群体内基因型为Rf5Rf5的植株小穗育性显著高于基因型为Rf5rf5的植株，说明Rf5对HL型粳稻不育系的恢复作用存在剂量效应。
　　(3)天丰A为广东农科院育成的WA型不育系，该不育系配合力好但存在高温结实现象，说明其可能携带有微效恢复基因。为改良天丰A不育性稳定性，本研究中配制了天丰A/珍汕97B//珍汕97B和天丰A/珍汕97B//天丰B群体。正常气温条件下，在这两个群体中，均出现结实单株，说明保持系珍汕97B与天丰B中都存在恢复基因，且2个保持系中的恢复基因可能存在互补作用和剂量效应。同时，天丰A/珍汕97B//珍汕97B群体内结实株的比例及育性水平低于天丰A/珍汕97B//天丰B群体，表明保持系天丰B中恢复基因的数目要多于珍汕97B。
　　(4)选取天丰A/珍汕97B//天丰B群体内可育株（株号P2-1014）为父本，天丰A为轮回亲本构建天丰A/珍汕97B//天丰B的BC4F1和BC4F2群体。2014年和2015年，根据BC4F1和BC4F2群体内植株的花粉育性和自然小穗育性，推断天丰A的育性恢复受1对显性基因控制，暂命名为Rf19(t)。
　　(5)选取BC4F1群体内可育株及不育株各50株分别混成可育池与不育池，采用SLAF-seq对两个池进行测序，在此基础上利用SNP index，ED算法和贝叶斯算法3种关联分析方法将Rf19(t)初步定位于第10染色体9.93～13.32Mb区段内。以BC4F2群体为精细定位群体，将Rf19(t)定位于第10染色体13.08～13.84Mb标记25300S-3/DraⅠ和RM25384之间，遗传距离分别为0.23cM和0.30cM。
　　(6) qRT-PCR结果表明Rf19(t)可降解线粒体不育基因WA352转录本，与已克隆的WA型主效恢复基因Rf4的育性恢复机制可能一致。Rf4编码PPR蛋白，根据RGAP(RiceGenome Annotation Project)网站提供的基因注释信息，推测定位区段内唯一编码PPR蛋白的Os10g26070可能为Rf19(t)的候选基因。
　　(7)测序结果表明，天丰中Os10g26070基因编码区的序列与珍汕97一致，而与群体内可育株（基因型为Rf1_9(t)Rf19(t）存在5个碱基差异，表明Rf19(t)不是来源于珍汕97B，但从定位区间来看，Rf19(t)仍然是一个新的WA型恢复基因。这些结果为Rf19(t)的克隆打下基础，为WA型三系的选育提供参考。

目录

摘要

符号说明

第1章 文献综述

1．1 水稻杂种优势利用

1．2 水稻细胞质雄性不育及恢复机理

1．2．1 水稻细胞质雄性不育机理

1．2．2 水稻细胞质雄性不育恢复机理

1．2．3 WA型细胞质雄性不育恢复性遗传与基因定位

1．2．4 BT型细胞质雄性不育恢复性遗传与基因定位

1．2．5 HL型细胞质雄性不育恢复性遗传与基因定位

1．3 Super-BSA(Super-Bulk Segregant Analysis)

1．4 本研究的目的与意义

第2章 Rfla(Rf5)对HL型粳稻不育系的恢复力研究

2．0 前言

2．1 材料与方法

2．1．1 供试材料

2．1．2 遗传群体的构建

2．1．3 育性鉴定

2．1．4 DNA提取与分子标记分析

2．1．5 测序

2．1．6 数据分析

2．2 结果与分析

2．2．1 HL型不育系及配制组合后代的花粉形态

2．2．2 泗R2982恢复基因的精细定位

2．2．3 候选基因的确认

2．2．4 Rf5对HL型粳稻不育系的恢复力

2．3 讨论

第3章 WA型恢复基因Rf19(t)定位

3．0 前言

3．1 材料与方法

3．1．1 供试材料

3．1．2 育性鉴定

3．1．3 DNA提取与分子标记分析

3．1．4 SLAF标签的开发及Super BSA快速定位

3．1．5 测序

3．1．6 qRT-PCR

3．1．7 统计方法与数据分析

3．2 结果与分析

3．2．1 育性鉴定

3．2．2 遗传分析

3．2．3 SLAF标签开发和Super BSA初步定位

3．2．4 SSR、InDel和CAPS标记的开发及连锁分析

3．2．5 Rf19(t)的作用方式

3．2．6 候选基因的预测

3．3 讨论

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间发表的学术论文

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