京海黄鸡ZP2基因启动子区甲基化对基因表达及产蛋数的影响分析

摘要

京海黄鸡拥有小型、优质、早熟、抗逆性强四大特点。从生产记录中发现其群体中存在300日龄产蛋数高和低的特殊个体。产蛋数作为数量性状，其不仅易受环境的影响，同时受到微效多基因的控制。本文着眼于这两点，选择了可能对京海黄鸡产蛋数具有影响的4个基因（ZP2基因、Stat5b基因、AMH基因、MDH1基因），采用qRT-PCR的方法研究了四个基因在300日龄京海黄鸡个体组织里的表达规律，重点剖析了卵巢组织里的表达状况，并通过双荧光素酶基因报告系统对ZP2基因核心启动子区域进行了研究，本文还采用BSP(Bisulfite Sequencing PCR)测序的方法，对卵巢组织中ZP2基因启动子区CpG岛的甲基化进行了定量检测，同时分析了重要甲基化位点对基因mRNA表达量的调控作用，结合启动子区潜在的转录因子结合位点的预测，分析甲基化位点所在区域，进一步探讨ZP2基因的分子调控机制。主要实验结果如下:
　　1.通过实时荧光定量检测4个基因在300日龄京海黄鸡9个组织中的mRNA的表达量发现，ZP2基因在卵巢中的表达丰度最高，其次是肾脏;Stat5b基因在腿肌中的表达丰度最高，其次是胸肌，在卵巢中的表达量较低;AMH基因在卵巢中的表达丰度最高，其它组织中的表达量较低;MDH1基因在心脏中的表达丰度最高，其次是腿肌，在卵巢中表达量较低。ZP2基因在高产组中的表达量极显著高于低产组(P＜0.01)，Stat5b基因和AMH基因在高产组的表达量低于低产组，但没有明显差异，MDH1基因在两组间的表达量几乎相同。以上结果说明，ZP2基因表达上调对京海黄鸡的产蛋数有一定影响，Stat5b基因和MDH1基因对京海黄鸡的产蛋数可能没有直接影响，AMH基因在卵巢中具有较高的表达量，但高低产组的表达差异不显著，其在京海黄鸡卵巢中发挥的作用还需进一步研究。
　　2.京海黄鸡ZP2基因启动子系列缺失片段在DF-1细胞中具有不同的启动子活性，重组质粒pGL3-P6的活性最高，pGL3-P5的活性明显下降，说明ZP2基因启动子的核心区域在-1552～-1348之间，与Neural Network PromoterPredietion在线网站预测的结果一致。
　　3.通过软件预测发现ZP2基因启动子区共有4个CpG岛，利用BSP技术检测启动子区CpG岛的甲基化状态。ZP2-1扩增片段总体甲基化程度与mRNA表达量有一定程度的负相关(R=-0.197，P=0.672)，所有单个位点的甲基化程度与mRNA表达量的相关性都没有达到显著水平;ZP2-2扩增片段总体的甲基化程度与mRNA的表达量也有一定程度的负相关（R=-0.264，P=0.567），其中mC-9位点的甲基化程度与mRNA存在极显著的负相关(P＜0.01)，但其并没有位于转录因子结合位点内，mC-20和mC-21位点的甲基化程度与mRNA存在显著的负相关(P＜0.05)，且都位于Sp1转录因子结合位点上，推测上述位点可能是调控转录的主要位点，且可能通过抑制Sp1和DNA的结合，从而抑制ZP2基因的转录。

目录

论文说明

摘要

第一章 文献综述

1．1 ZP2基因研究进展

1．2 Stat5b基因研究进展

1．3 AMH基因研究进展

1．4 MDH1基因研究进展

2 DNA甲基化

2．1 DNA甲基化与CpG岛

2．2 DNA甲基化的研究方法

3．1 真核启动子的结构

3．2 启动子的研究热点

4 本研究的目的和意义

第二章 四个基因在300日龄京海黄鸡个体中的表达谱及高低产中的差异表达分析

1．1 试验材料

1．2 试验方法

1．3 统计软件和方法

2 结果与分析

2．1 RNA质量检测

2．2 四个基因的组织表达谱分析

2．3 四个基因在300日龄高、低产组京海黄鸡卵巢组织中的差异表达分析

3 讨论

4 结论

第三章 ZP2基因启动子区缺失载体的构建及核心启动子分析

1．1 试验材料

1．2 试验方法

1．3 数据处理和分析

2 结果与分析

2．1 ZP2基因核心启动子区预测

2．2 缺失载体转染DF-1细胞后的活性测定与分析

3 讨论

4 结论

第四章 ZP2基因启动子区甲基化对mRNA表达的影响分析

1 材料与方法

1．1 试验材料

1．2 试验方法

1．3 统计方法

2 结果与分析

2．1 DNA的提取结果

2．2 ZP2基因CpG岛预测结果

2．3 目的基因的扩增片段

2．4 ZP2基因CpG岛甲基化BSP测序结果

2．5 甲基化与基因表达量的皮尔森相关性分析

2．6 ZP2基因潜在转录因子结合位点预测

3 讨论

4 结论

全文结论

参考文献

致谢

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