枯草芽孢杆菌对雪山鸡生产性能、肠道健康和免疫机能的影响及机制

摘要

随消费者对食品安全和动物生产过程中因抗生素使用不当而引起畜产品中残留的问题关注与日俱增，研究探索新型抗菌饲料添加剂成为热点课题。以有益微生物菌群研制开发的饲用微生物添加剂，作为一类新型无公害饲料添加剂已被广泛使用。枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis，BS)是一种优质、安全的益生菌，它具有提高动物生长性能、增强机体免疫、抗菌能力、改善肠道菌群、提高机体抗氧化功能等多种功能。虽然芽孢杆菌对肉鸡的功效已经得到了广泛的认识，围绕这一主题的研究也很多，但基本上都以快速型白羽肉鸡为研究对象。以慢速型优质型鸡为研究对象的研究甚少，而现在国内慢速型优质鸡占整体肉鸡养殖量近50％，雪山鸡为我国地方优质黄羽肉鸡品种之一。本论文旨在阐明枯草芽孢杆菌对雪山鸡的生产性能和免疫功能的影响及其作用机理，为慢速型优质型鸡合理使用饲用芽孢杆菌提供理论指导。研究内容如下:
　　试验一、研究BS对大肠杆菌(E.coli)和沙门氏菌的体外抑菌作用
　　选择8株BS菌株BS044、BS048、BS050、BS075、BS090、BS155、BS281和BS306，以抑菌圈试验评估其对2株标准菌株(E.coli K88菌株)和肠炎沙门氏菌(Salmonellaenteritis，SEATCC13076菌株)和61株临床分离株(29株E.coli、32株沙门氏菌)的抑菌作用。结果发现:(1)BS048和BS155对E.coli K88菌株的抑菌圈较大(20.5±0.3 mm、15.8±1.1 mm)，抑菌效果较强，BS090和BS306的抑菌圈较小(8.6±0.7 mm、10.1±0.6 mm)，抑菌效果较弱;(2)BS048和BS155对SE ATCC13076的抑菌圈较大(19.2±0.7 mm、17.3±0.9 mm)，抑菌效果较强，BS090的抑菌圈较小(11.2±0.8 mm)，抑菌效果较弱;(3)BS048、BS155菌株分别能够抑制20株和12株E.coli临床分离菌株，抑菌谱较广，BS090、BS306菌株仅分别能抑制2株和5株，抑菌谱较窄;(4)BS048、BS155菌株均能够抑制23株沙门氏菌临床分离株，抑菌谱较广，BS090仅抑制7株，抑菌谱较窄。综合上述结果，BS048和BS155表现出较好的E.coli和沙门氏菌双抑菌活性。故将BS048和BS155作为试验菌株进行后续的雪山鸡生长试验。
　　试验二、枯草芽孢杆菌对雪山鸡生产性能、养分消化率、盲肠菌群变化、维持肠道健康作用及机理
　　选取1470只体重相近(35.0 g±1.0 g)的1日龄雪山公鸡随机分为对照组（基础饲粮）、BS048组(添加0.1％(W/W)BS048的基础日粮）和BS155组(添加0.1％(W/W)BS155的基础日粮），饲养80d。测定了BS048和BS155分别对雪山鸡生长性能、成活率、小肠食糜粘度与pH、空肠消化酶活性、盲肠挥发性脂肪酸(volatile fatty acid，VFA)的影响。结果发现:与对照组相比，BS048组雪山鸡的日增重(average daily gain, ADG)、日采食量(average daily feed intake，ADFI)、空肠消化酶（淀粉酶、脂肪酶、胰蛋白酶）活性和盲肠VFA含量均有显著提高(P＜0.05），小肠食糜粘度则显著降低(P＜0.01），料肉比、小肠食糜pH则无显著变化(P＞0.05），而BS155组仅ADFI、空肠淀粉酶和盲肠VFA含量显著提高(P＜0.05）;成活率各组间差异均不显著。由此可见，BS048不仅能够降低小肠食糜粘度并提高空肠消化酶活性，增强肠道的消化功能，而且可以促进盲肠VFA的产生，维持并改善肠道健康状况，从而提高雪山鸡的生长性能。虽然BS155对雪山鸡肠道的作用机制和BS048相似，但没有表现出明显的促生长效果。
　　雪山鸡80日龄时，添加枯草芽孢杆菌处理组，雪山鸡对粗蛋白质和能量的表观利用率显著提高，且BS048与BS155两组间没有显著性差异，对干物质、钙和磷的表观利用率均没有明显的影响。在20、40日龄时，添加枯草芽孢杆菌BS048和BS155活菌制剂后均提高了雪山鸡盲肠菌群多样性，并且BS048表现优于BS155。综合本节3个试验，BS048的功效相比BS155更好，故后续章节仅研究BS048的免疫调节和抗感染机理。
　　试验三、研究BS048对雪山鸡抗沙门氏菌(Salmonella)感染防御能力的影响
　　选取240只体重相近(35.0 g±1.0 g)的1日龄雪山鸡（公，SE阴性）随机分为四组，对照组、对照感染组、BS组和BS感染组(前两组饲喂基础日粮，后两组饲喂添加0.1％(W/W)BS048的基础日粮），每组设3个重复，每个重复20只，饲养14天;两个感染组在5-7日龄时每天以1×108CFU SE感染试验鸡只。观察BS048对正常和SE感染雪山鸡盲肠粘膜、肝脏、肾脏SE荷菌量、空肠粘膜结构、血液Ig、空肠分泌型IgA(secretoryIgA，sIgA)、空肠粘膜碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)、髓过氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)活性、抗氧化功能以及紧密连接蛋白、Toll样受体(Toll-likereceptor，TLR)和炎症因子基因表达的影响。结果显示:(1)对于正常雪山鸡，BS048能够显著促进空肠粘膜发育及其sIgA分泌(P＜0.05），提高空肠粘膜ALP活性(P＜0.05）和小肠抗氧化功能(P＜0.05），诱导空肠粘膜细胞的紧密连接蛋白(CLDN-1、OCLN、ZO-1)、TLR2和炎症因子(IL-6、IL-10)(P＜0.05)表达;(2)对于SE感染雪山鸡，BS048能够显著减少SE感染雪山鸡盲肠粘膜、肝脏和肾脏中的SE数量(P＜0.01），促进小肠粘膜结构的损伤恢复以及生长发育，促进血液Ig和肠道sIgA分泌(P＜0.05），提高空肠粘膜ALP活性(P＜0.05)并降低MPO活性（P＜0.01），提高小肠抗氧化功能(P＜0.05），上调空肠粘膜的紧密连接蛋白(CLDN-1、OCLN、ZO-1)基因表达并下调TLR(TLR2、TLR4)与炎症因子(IL-6、IFN-γ、IL-10)的基因表达。由此可见，BS048能够增强雪山鸡的肠粘膜屏障功能、机体免疫和抗SE感染能力，包括:(1)促进小肠粘膜发育以及感染后的恢复;(2)增强机体的体液免疫和肠道粘膜免疫;(3)增强肠道抗氧化功能，缓解因细菌感染引起的氧化应激，保护组织及其正常功能;(4)增强肠粘膜物理屏障;(5)增强空肠粘膜对病原体的识别和防御能力。
　　试验四、研究BS048对鸡巨噬细胞免疫功能的影响
　　本研究以108CFU/mL BS048处理HD11鸡巨噬细胞系，并以LPS处理(100 ng/mL)为阳性对照，观察BS048对HD11细胞活化以及吞噬杀菌、细胞因子分泌和NO合成等功能的影响。结果发现:(1)BS048对胞外乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase，LDH)活性没有显著影响(P＞0.05)，其具有良好的安全性;(2)BS048能够显著提高HD11细胞内的酸性磷酸酶和LDH活性(P＜0.05），表明其导致了HD11细胞活化;(3)BS048能够显著增强HD11细胞的吞噬功能以及其杀伤胞内SE的能力(P＜0.01);(4)BS048能够显著上调HD11细胞的促炎因子IL-1β、IL-6，抑炎因子IL-10、TGF-β1，抗病毒因子IFN-β的基因表达(P＜0.01），表明BS048具有很强的抗炎能力;(5)BS048能够显著上调HD11细胞的iNOS基因表达(P＜0.01)，增加iNOS活性和胞外NO含量(P＜0.01），表明其能够显著增强HD11细胞的NO合成能力。由上可见，BS048不仅对鸡巨噬细胞有良好的安全性，而且能够活化鸡巨噬细胞以增强雪山鸡的免疫功能和抗SE感染能力。
　　综合上述研究获得结论:(1)BS048对标准及临床分离的E.coli和沙门氏菌菌株均有较好的体外抑制作用;(2)BS048通过增强肠道消化功能和改善肠道健康，提高雪山鸡的生长性能;(3)BS048通过增强巨噬细胞功能、肠道粘膜屏障、机体免疫，改善雪山鸡的肠道健康和抗沙门氏菌感染能力。可见，BS048是一株适用于雪山鸡的优质益生菌。

目录

摘要

缩略词表

第一章 文献综述

1 引言

2 益生菌

2．1 益生菌定义

2．2 益生菌在家禽生产中的作用

2．3 益生菌的作用模式及机制

2．4 影响益生菌在家禽上应用的因素

2．5 益生菌筛选及安全性评价

3 益生芽孢杆菌

3．1 枯草芽孢杆菌的作用机理的研究进展

3．2 枯草芽孢杆菌在肉鸡上的应用效果

4 家禽的肠道屏障与肠道免疫

4．1 家禽的肠道屏障功能

4．2 家禽肠道免疫的研究

4．3 芽孢杆菌对肠道免疫系统作用机理

4．4 巨噬细胞的来源与功能

5 本研究的目的、意义及内容

5．1 研究的目的、意义

5．2 研究内容

第二章 枯草芽孢杆菌对大肠杆菌和沙门氏菌的体外抑菌作用筛选

1 材料与方法

1．1 试验材料

1．2 试剂及仪器

1．3 试验方法

2 结果与分析

2．1 BS菌株对大肠杆菌和沙门氏菌标准菌株体外抑菌试验

2．2 BS菌株对大肠杆菌和沙门氏菌临床分离株抑菌试验

3 讨论

4 小结

第三章 枯草芽孢杆菌对雪山鸡生产性能、养分消化率、盲肠菌群变化、维持肠道健康作用及机理

1 材料与方法

1．1 试验材料

1．2 试验动物、分组设计及饲养管理

1．3 样品收集及处理

1．4 试剂及仪器

1．5 指标测定

1．6 数据统计分析

2 结果与分析

2．1 饲粮中添加BS对雪山鸡生长性能的影响

2．2 饲粮中添加BS对雪山鸡肠道食糜粘度和pH值的影响

2．3 饲粮中添加BS对雪山鸡空肠消化酶活性的影响

2．4 饲粮中添加BS对雪山鸡盲肠中挥发性脂肪酸含量的影响

2．5 饲粮中添加BS对雪山鸡养分利用的影响

2．6 饲粮中添加BS对雪山鸡盲肠菌群的影响

3 讨论

3．1 饲粮中添加BS对雪山鸡生长性能的影响

3．2 饲粮中添加BS对雪山鸡小肠消化功能的影响

3．3 饲粮中添加BS对雪山鸡盲肠VFA含量的影响

3．4 饲粮中添加BS对雪山鸡养分利用的影响

3．5 饲粮中添加BS对雪山鸡盲肠菌群的影响

4 小结

第四章 枯草芽孢杆菌对雪山鸡抗沙门氏菌感染防御能力的影响

1 材料与方法

1．1 试验材料

1．2 试验动物、分组设计及饲养管理

1．3 试剂及仪器

1．4 样品收集

1．5 指标测定

1．6 数据统计与分析

2 结果与分析

2．1 BS048对雪山鸡盲肠粘膜、肝脏、肾脏荷菌量的影响

2．2 BS048对雪山鸡小肠粘膜结构的影响

2．3 BS048对雪山鸡血液Ig与肠道sIgA分泌的影响

2．4 BS048对雪山鸡空肠粘膜ALP和MPO活性的影响

2．5 BS048对雪山鸡肠道抗氧化功能的影响

2．6 BS048对雪山鸡空肠紧密连接蛋白、TLR、细胞因子基因表达的影响

3 讨论

3．1 BS048对雪山鸡盲肠粘膜、肝脏、肾脏荷菌量的影响

3．2 BS048对雪山鸡肠道结构与功能的影响

3．3 BS048对雪山鸡体液免疫和肠道粘膜免疫的影响

3．4 BS048对雪山鸡肠道粘膜损伤和局部炎症反应的影响

3．5 BS048对雪山鸡肠道抗氧化功能的影响

3．6 BS048对雪山鸡肠道紧密连接蛋白、TLRs、炎症因子基因表达的影响

4 小结

第五章 枯草芽孢杆菌对鸡巨噬细胞免疫功能的影响

1．2 试剂与仪器

1．3 试验方法

1．4 数据统计与分析

2 结果与分析

2．1 BS048的细胞毒性评估

2．3 BS048对HD11细胞吞噬功能和胞内杀菌能力的影响

2．4 BS对HD11细胞的细胞因子和iNOS基因表达的影响

2．5 BS048对HD11细胞NO合成能力的影响

3 讨论

3．4 BS048对HD11细胞细胞因子分泌的影响

4 小结

第六章 论文总体讨论、结论、创新点和研究展望

论文总体讨论

2 结论

3 创新点

4 研究展望

参考文献

致谢

攻读学位期间发表的学术论文

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