CDC25C基因在成年山羊与幼年山羊卵巢颗粒细胞中的表达及功能验证

摘要

卵泡颗粒细胞是卵泡的一种重要组成单位，环绕于卵母细胞周围。随着卵泡的发育，卵泡颗粒细胞会发生相应的变化，其增殖分泌的多种激素及生长因子与卵母细胞的生长和成熟有着极为重要的作用。
　　本研究前期发现，幼龄母羊与成年母羊的卵母细胞在体外成熟过程中，成熟率有着显著性差异，并且幼龄母羊的卵母细胞经体外成熟受精后发育至四细胞的比例也显著性低于成年母羊。试验中发现，幼龄母羊与成年母羊的卵泡颗粒细胞有着很大的不同点，无论是数量，还是环绕卵母细胞的形态。
　　另一个发现就是细胞分裂周期蛋白25同源蛋白C基因在幼龄母羊卵母细胞与成年母羊卵母细胞中的表达有显著性差异，这个基因具有调控细胞分裂周期作用，可调节真核生物细胞有丝分裂，是细胞周期进入M期的关键因子之一。
　　综合上述两种发现，本实验决定从卵泡颗粒细胞的角度验证CDC25C基因功能，尝试解开不同年龄阶段卵母细胞成熟率差异的原因。本实验以江苏南通当地白山羊为研究对象，采集1.5年龄以上的成年母羊与2月龄羔羊的卵巢并使用0.01M PBS带回实验室。体外分离卵泡颗粒细胞经培养转染后，对成年母羊与羔羊的卵泡颗粒细胞进行了CDC25C、CDK1、WEE1相关基因，雌激素和孕激素，转染后细胞周期等相关检测，结果如下:
　　1.山羊CDC25C基因的克隆
　　根据NCBI提供的CDC25C基因序列，设计引物克隆CDC25C基因的CDS区，随后构建该基因的pCMV-HA-CDC25C载体和小分子干扰载体siCDC25C。测序结果表明pCMV-HA-CDC25C载体构建正确，与此同时小分子干扰载体siCDC25C在预实验中被证实有效，皆可用于后续试验。
　　2.原代分离细胞的鉴定
　　依据酶联免疫原理，山羊卵泡颗粒细胞表面拥有特异性FSH受体，试验采用RabbitAnti-FSHR多克隆抗体作为一抗，SA1074-兔IgG为二抗，经过酶联免疫检测后认定，本实验分离的细胞绝大部分都是所需要的卵泡颗粒细胞，可继续后续试验。
　　3.CDC25C基因对卵泡颗粒细胞的影响
　　构建pCMV-HA-CDC25C载体和小分子干扰载体siCDC25C，转染成年山羊和幼龄山羊卵泡颗粒细胞后，利用实时荧光定量PCR技术对CDC25C、CDK1、WEE1基因的相对表达量进行检测，利用酶联免疫方式检测了PROG和E2两种激素分泌情况，利用切片技术比较了成年山羊与幼龄山羊卵巢的区别，利用细胞周期检测技术比较了两种山羊卵泡颗粒细胞转染重组载体和干扰载体后的细胞周期区别。
　　(1)转染pCMV-HA-CDC25C载体后，成年山羊的卵泡颗粒细胞的CDC25C、CDK1、WEE1基因的相对表达量都得到了显著性提升;PROG和E2两种激素的分泌量也有所上升，且与空白组比较差异显著;成年山羊卵巢上的卵泡较少，但发育程度更好;细胞中分裂期占间期的比例得到显著性上升。转染pCMV-HA-CDC25C载体后，幼龄山羊的卵泡颗粒细胞的CDC25C基因的相对表达量得到上升，但是CDK1、WEE1基因的相对表达量却出现了下降;PROG和E2两种激素的分泌量也有所上升;幼龄山羊卵巢上的卵泡更多，但发育程度不好;细胞中分裂期占间期的比例得到显著性上升。
　　(2)转染小分子干扰载体siCDC25C后，成年山羊的卵泡颗粒细胞的CDC25C、CDK1、WEE1基因的相对表达量都有所下降;PROG和E2两种激素的分泌量有一定上升;细胞中分裂期占间期的比例有显著性下降。幼龄山羊的卵泡颗粒细胞的CDC25C、CDK1、WEE1基因的相对表达量均有所下降;PROG和E2两种激素的分泌量有一定上升;细胞中分裂期占间期的比例有显著性下降。

目录

论文说明

摘要

符号说明

第一章 文献综述

1．1 卵泡颗粒细胞

1．2 CDC25C基因与细胞周期

1．3 CDC25C与相关基因的关系

1．4 本研究的目的和意义

第二章 CDC25C基因表达载体的构建及其在山羊卵泡颗粒细胞中的功能分析

2．1 试验材料

2．1．1 主要仪器

2．1．2 器材的准备

2．1．3 主要试剂

2．1．4 主要溶液配置

2．2 试验方法

2．2．1 山羊卵巢颗粒细胞的分离培养

2．2．2 中性红染色液(活细胞染色)

2．2．3 免疫荧光染色

2．2．4 山羊颗粒细胞总RNA的提取和检测

2．2．5 过表达重组载体的构建

2．2．6 山羊卵巢颗粒细胞转染

2．2．7 荧光定量PCR

2．2．8 不同处理组中孕激素和E2含量的检测

2．2．9 成年母羊与幼龄母羊卵巢切片观察及二者卵泡颗粒细胞所处细胞周期比较

2．2．10 数据处理

2．3 实验结果

2．3．1 山羊卵泡颗粒细胞体外培养

2．3．2 pCMV-HA载体-CDC25C构建

2．3．3 荧光定量PCR结果

2．3．4 酶联免疫分析法测定PROG和E2激素量的实验结果

2．3．5 成年母羊与幼龄母羊卵巢切片观察及二者卵泡颗粒细胞所处细胞周期比较

2．4 讨论

2．4．1 CDC25C基因相对表达量

2．4．2 CDC25C基因对CDK1和WEE1基因的影响

2．4．3 CDC25C基因对PROG和E2的影响

第三章 CDC25C基因siRNA的构建及其在山羊卵泡颗粒细胞中的功能分析

3．1 试验材料

3．1．1 主要仪器

3．1．2 器材的准备

3．1．3 主要试剂

3．2．3 免疫荧光染色

3．2．4 山羊颗粒细胞总RNA的提取和检测

3．2．7 荧光定量PCR

3．2．8 不同处理组中孕激素和E2含量的检测

3．3．2 siRNA序列

3．3．3 荧光定量PCR结果

3．3．5 成年母羊与幼龄母羊卵巢切片观察及二者卵泡颗粒细胞所处细胞周期比较

3．4 讨论

3．4．2 CDC25C基因对CDK1和WEE1基因的影响

3．4．3 CDC25C基因对PROG和E2的影响

全文结论

参考文献

致谢

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