抗葡萄球菌蛋白P128表达、纯化及其对牛源葡萄球菌的抗菌活性研究

摘要

抗葡萄球菌嵌合蛋白P128是由葡萄球菌噬菌体K细胞壁降解酶活性区与溶葡萄球菌素细胞壁结合区组成的杂合肽，对耐药葡萄球菌具有较强的溶（杀）活性。国外用大肠杆菌成功表达了重组P128，但需两步硫酸铵沉淀和离子交换层析纯化。本课题组以类弹性蛋白多肽(Elastin-like polypeptide，ELP)为纯化标签，用脑膜炎奈瑟氏菌FrpC蛋白自加工元件切割ELP标签，但切割效率较低，重复性较差。
　　烟草蚀纹病毒(Tobacco etch virus，TEV)蛋白酶是该病毒核包涵体蛋白酶的催化活性区，具有识别序列特异性强、切割活性受目的蛋白氨基酸序列影响小和反应兼容性好等优点。本课题组研制的自聚肽融合TEV蛋白酶不仅可用离心洗涤法分离纯化，而且切割反应结束后能用离心法去除。本研究探索用自聚肽融合TEV蛋白酶切割ELP标签可行性，旨在提高重组P128产量，为相关基因工程产品开发打好基础。
　　用PCR扩增P128编码序列，5'端引入TEV蛋白酶切割位点，将PCR产物插入融合表达载体pELP-Fh8，用重组载体pELP-Fh8-P128转化大肠杆菌，对IPTG浓度等表达条件进行了优化，结果显示ELP-Fh8-P128融合蛋白获得正确表达，表达产物为可溶性蛋白。利用温度敏感相变循化(ITC)纯化融合蛋白，对相变温度和盐浓度进行了优化，经两轮ITC获得的ELP-Fh8-P128融合蛋白纯度达90％。对TEV蛋白酶活性包涵体表达、纯化和切割条件进行了优化，用离心洗涤法获得了高纯度融合蛋白酶。在优化条件下切割ELP-Fh8-P128融合蛋白，用ITC去除ELP-Fh8标签，结果显示切割效率高达95％，获得的重组P128纯度达98％，产量为75mg/L细菌培养。
　　收集奶牛乳房炎相关金黄葡萄球菌11株，凝固酶阴性葡萄球菌31株，通过药敏试验筛选耐头孢西丁菌株7株，进而用重组P128分别进行抑（杀）菌试验，用MTT法检测P128对牛肾细胞的细胞毒性。结果显示:除对1株耐头孢西丁金黄和沃氏葡萄球菌无效外，重组P128对9株金黄葡萄球菌的抑菌活性在0.23～0.94μg/ml之间，杀菌活性在0.94～15μg/ml之间;对6种凝固酶阴性葡萄球菌的抑菌活性在0.12～1.88μg/ml之间，杀菌活性在0.94～30μg/ml之间;对耐头孢西丁葡萄球菌的抑（杀）菌活性低于敏感菌株;对牛肾细胞无明显细胞毒性。

目录

摘要

符号说明

综述一、抗菌肽研究进展

1．抗菌肽的性质

2．抗菌肽的分类

3．抗菌肽的作用机制

4．抗菌肽的生物活性

5．抗菌肽存在的问题及前景

综述二、抗葡萄球菌P128蛋白及其表达研究进展

1．P128蛋白研究进展

2．类弹性蛋白多肽研究进展

3．TEV蛋白酶

4．Fh8可溶性标签

研究内容一、抗葡萄球菌蛋白P128的融合表达及其ELP标签切除

1．实验材料

1．1 质粒及菌株

1．2 主要试剂与工具酶

1．3 主要仪器设备

1．4 培养基与试剂

2．方法

2．1 表达载体构建

2．2 融合蛋白表达与分析

2．3 融合蛋白的纯化

2．4 重组P128的制备

3 结果

3．1 目的基因扩增

3．2 表达载体鉴定

3．3 融合P128表达分析

3．4 IPTG浓度优化

3．5 诱导表达时间优化

3．6 ITC氯化钠浓度测定

3．7 ITC温度的确定

3．9 ELK16-EVP纯化

3．1 0 ELK16-TEVP切割浓度的确定

3．1 1 重组P128的获得

4 讨论

研究内容二、重组P128对牛源葡萄球菌的抗菌活性研究

1．材料

1．1 菌株与细胞

1．2 试剂与耗材

1．3 主要仪器设备

1．4 溶液试剂配制

2 方法

2．1 葡萄球菌的筛选

2．2 抑菌活性的测定

2．3 细胞毒性试验

3 结果

3．1 药敏试验

3．2 凝固酶试验

3．3 重组P128的抑菌活性测定

3．4 细胞毒性测定

4．讨论

参考文献

致谢

声明