基于hexon蛋白的检测禽腺病毒抗体的ELISA方法的建立

摘要

禽腺病毒(Fowl Adenovirus，FAdV)属于腺病毒科禽腺病毒属。基于限制性酶切图谱分析以及血清交叉中和试验，目前可将FAdV划分为5个基因型(A-E)，12个血清型（血清型1-7、8a、8b、9-11）。流行病学研究发现，FAdV在世界范围内广泛分布，且不同日龄的家禽均易感。FAdV感染一般引起亚临床症状，而急性感染主要以包涵体肝炎、肝炎-心包积液综合症以及肌胃糜烂等为主。自2013年以来，国内大部分地区鸡群中流行暴发肝炎-心包积液综合症，感染鸡群的死淘率可高达80％，对国内养鸡业造成了严重的经济损失。然目前对FAdV尚无有效的疫苗和药物进行预防和治疗，更缺乏可靠的FAdV血清学检测方法。本研究从禽腺病毒保守基因hexon着手，分别构建了GST-hexon和pET-hexon、 pCold-hexon的分段原核表达载体，进行了融合蛋白的纯化，并利用纯化的融合蛋白建立了检测FAdV抗体的间接ELISA方法。
　　1、hexon基因的分段原核表达及纯化
　　本研究选取禽腺病毒5个基因型毒株，通过比对其hexon蛋白氨基酸序列，选择比较保守的4段表位，设计引物克隆至pGEX-6P-1原核表达载体中，阳性质粒分别命名为GST-hexon1、GST-hexon2、GST-hexon3和GST-hexon4。IPTG诱导表达后，经SDS-PAGE分析发现，原核表达的重组蛋白主要在沉淀中以包涵体的形式存在。Western blot鉴定发现，原核表达的重组蛋白只有GST-hexon1与抗FAdV的鸡阳性血清具有良好反应性。进而将hexon1片段克隆至pET-32a和pColdⅠ载体中进行蛋白可溶性表达尝试。经SDS-PAGE分析发现，原核表达产物仍然在沉淀中以包涵体的形式存在。随即对包涵体进行了纯化，蛋白浓度可达0.5mg/mL。SDS-PAGE以及Western blot分析表明，纯化的重组蛋白具有很好的纯度及良好的抗原反应性。这一纯化的hexon1重组蛋白的获得为进一步建立检测FAdV抗体的间接ELISA方法提供了材料。
　　2、检测FAdV抗体的间接ELISA方法的建立
　　利用纯化的hexon1重组蛋白作为包被抗原，建立了检测FAdV抗体的间接ELISA方法。实验数据表明，抗原的最佳包被浓度为6.2μg/mL;一抗最佳稀释度为1∶400，最佳孵育时间为60min;酶标二抗最佳稀释度为1∶50000，最佳孵育时间为45min;显色时间为10min。该ELISA的CUT-OFF值为OD≧0.173。特异性检测发现，建立的ELISA与新城疫病毒、禽白血病病毒、马立克氏病毒、传染性支气管炎、传染性法氏囊病病毒阳性血清以及SPF鸡血清均没有反应，OD值均低于0.1548;仅与检测的抗FAdV的阳性血清反应。临床应用检测表明，该ELISA能用于检测FAdV免疫鸡群抗FAdV抗体水平。这些研究结果表明，本研究建立的基于Hexon蛋白的检测FAdV抗体的间接ELISA方法在FAdV感染及免疫监测中具有一定的应用价值。

目录

摘要

符号说明

第一章 文献综述

第一节 禽腺病毒概况

1．1 禽腺病毒的分类

1．2 禽腺病毒的形态结构与理化特性

1．3 禽腺病毒的基因组结构

1．4 禽腺病毒的主要编码蛋白及其功能

1．5 禽腺病毒的流行病学与致病性

1．6 禽腺病毒的诊断技术

第二节 研究的目的与意义

第二章 禽腺病毒hexon基因片段的原核表达及纯化

1 材料

1．1 病毒、载体与菌种

1．2 主要试剂

1．3 主要仪器

2 方法

2．1 病毒DNA的提取

2．2 禽腺病毒保守基因片段的PCR扩增

2．3 原核表达载体的线性化与回收

2．4 重组表达载体的构建与鉴定

2．5 重组蛋白的诱导表达及鉴定

2．6 Hexon蛋白的提取、纯化及鉴定

2．7 hexon基因可溶性表达尝试

2．8 pET-32a及pCold Ⅰ重组表达载体的构建与鉴定

2．10 His标签重组蛋白的纯化

3 结果与分析

3．1 hexon基因片段的扩增

3．2 重组质粒的PCR鉴定

3．3 GST重组蛋白的诱导表达

3．4 GST重组蛋白的Western-blot鉴定

3．5 GST重组蛋白的纯化

3．6 用于构建pET-hexon1和pCold-hexon1载体的基因PCR扩增

3．7 His标签重组质粒的酶切鉴定

3．8 His标签重组质粒的诱导表达

3．9 His标签重组蛋白的western blot鉴定及纯化

4 小结与讨论

第三章 间接ELISA检测FAdV抗体方法的建立

1 材料

1．1 生物材料

1．2 主要试剂与耗材

1．3 主要仪器

2 方法

2．1 间接ELISA方法检测抗体常规步骤

2．2 ELISA方法反应条件的优化

2．3 ELISA结果判定标准的确定

2．4 ELISA方法特异性试验

2．5 间接ELISA方法的应用

3 结果与分析

3．1 ELISA方法反应条件的确定

3．2 ELISA方法结果判定标准的确定

3．3 特异性试验

3．4 ELISA方法的初步应用

4 小结与讨论

全文总结

参考文献

攻读学位期间发表的学术论文

致谢

声明