落新妇苷对大鼠肝脏缺血再灌注损伤及自噬的影响

摘要

目的:
　　1、探索大鼠正常肝脏和缺血再灌注损后肝脏中的细胞自噬现象。
　　2、探讨落新妇苷对大鼠肝脏缺血再灌注损伤（HIRI）预处理的作用机制，观察保护效应与自噬水平的变化，为肝脏缺血再灌注损伤的治疗提供一定的依据。
　　方法:
　　1、实验分组:54只健康SD大鼠（均为雄性，体重大约250～300g）随机分为3组，分别为落新妇苷预处理组、HIRI组（缺血再灌注组）以及Sham组（假手术组），每组18只;再按术后4h、8h、16h三个时间段，每个时间段各6只。
　　2、建立模型:各组大鼠术前12h禁食、不禁水，落新妇苷预处理组，术前7天开始每日上午08:00给予落新妇苷腹腔按照剂量为每千克大鼠40毫克注射，HIRI组和Sham组给予同样剂量生理盐水每日上午08:00腹腔注射。落新妇苷预处理组和HIRI组大鼠腹腔注射戊巴比妥钠30 mg/kg麻醉后，行腹部正中切口，逐层切开，打开腹膜进入腹腔，暴露肝脏，找到第一肝门;游离支配肝左、中叶的脉管，并用无创血管夹夹闭脉管的共干，观察肝脏颜色的变化，肝左、中叶的颜色变深，即已建立约70％的肝脏缺血模型;夹闭时间大约45分钟，重新恢复血流，逐层缝合切口。Sham组仅行上腹部正中切口，逐层进入腹腔后轻轻游离肝门，无需夹闭脉管，直接缝合关腹。
　　3、样本的采集和观察指标的测定:分别于手术后4h、8h、16h取抽取下腔静脉血及大鼠肝左外叶作为标本，检测血清谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)，光学显微镜下观察Sham组、HIRI组及落新妇苷组不同时间段的肝细胞显微结构变化;Western Blot分析肝组织中LC3、Beclin-1的表达;电镜下观察肝脏组织内自噬小体数量情况。
　　结果:
　　1、54只健康SD大鼠手术后都能在一定时间内复苏，维持有效的呼吸与心跳，并且能相应活动。
　　2、术后肝功能主要是检测血清ALT和AST水平的变化，HIRI组的ALT和AST水平较假手术组明显升高，而落新妇苷组与HIRI组相比明显降低，且有统计学意义(P＜0.05)。
　　3、术后肝组织HE染色显示Sham组肝小叶、肝汇管区结构显示清晰，肝细胞形态正常，无炎性细胞浸润。术后4h时，HIRI组中肝细胞索排列出现紊乱，部分肝细胞出现肿胀，并有炎性细胞浸润;落新妇苷组中只见少许肝细胞水肿。术后8h HIRI组，肝细胞索排列严重紊乱，肝汇管区结构显示模糊，出现肝细胞的大片坏死;落新妇苷组肝细胞只见轻度水肿，少量炎性细胞浸润，肝汇管区结构显示清晰。术后16h HIRI组中肝细胞损伤减轻，细胞形态较前有改善;落新妇苷组中肝细胞的形态基本正常。
　　4、通过Western blotting检测术后肝组织中LC3、Beclin-1蛋白的表达，与相Sham组比较，HIRI组的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ灰度值比值及Beclin-1灰度值在术后各个时段均明显升高且有统计学意义(P＜0.05)，在8h时达到高峰，在16h时下降。落新妇苷组的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ及Beclin-1灰度值比值在术后各个时段均较HIRI组下降，且有统计学意义(P＜0.05);结果提示落新妇苷在术后各个时段均可以减轻LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白比值和Beclin-1蛋白的表达。
　　5、电镜下观察再灌注8小时三组大鼠肝脏的自噬小体的数量，结果显示，与Sham组(0.69±0.04)大鼠肝脏的平均自噬小体数量相比，HIRI组（7.12±0.60）大鼠肝脏的平均自噬小体数量有所增多，且有统计学意义(P＜0.05);与HIRI组大鼠肝脏的平均自噬小体数量相比，落新妇苷组（3.68±0.42）大鼠肝脏的平均自噬小体数量有所下降，且有统计学意义(P＜0.05)。
　　结论:
　　结果显示，经过落新妇苷预处理后，大鼠肝脏缺血再灌注损伤后血清转氨酶水平明显下降，光镜下观察发现落新妇苷组较HIRI组肝细胞形态及炎症浸润情况等明显减轻。LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ灰度值比值以及Beclin-1灰度值在术后各个时段均较HIRI组下降，提示落新妇苷可减轻术后LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白比值和Beclin-1蛋白的表达，表明落新妇苷预处理可降低大鼠HIRI后的自噬水平。电镜下的结果显示正常大鼠术后也存在少量自噬小体，HIRI组自噬小体最多，而落新妇苷组肝脏细胞的自噬小体数量比HIRI组有所减少，这也证实了落新妇苷预处理确实降低了大鼠HIRI后的自噬水平。
　　综上所述，正常大鼠肝脏也存在自噬现象，落新妇苷预处理可减轻大鼠HIRI，其怍用机制可能与下调LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白比值及Beclin-1蛋白的水平，从而抑制自噬有关。本实验从自噬的角度来分析落新妇苷对大鼠HIRI的保护作用，对HIRI的临床治疗提供，了相关的实验依据。

目录

摘要

英文缩略词表

前言

材料与方法

1、实验材料

2 实验方法

3 统计学分析

实验结果

一、血清ALT和AST水平的变化

二、肝组织HE染色

三、Western blotting检测肝组织中LC3、Beclin-1蛋白的表达

四、电镜下观察肝脏的自噬小体情况

讨论

结论

参考文献

综述：自噬与肝脏缺血再灌注损伤

致谢

攻读硕士学位期间发表的文章

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