孕酮对奶牛子宫内膜上皮细胞增殖作用机制的研究

摘要

奶牛子宫内膜炎（Endometritis）是奶牛常见产科疾病，其发生与异常生产、胎衣不下、产后子宫感染、激素水平失调、环境因素、营养不均衡等因素相关。子宫内膜炎往往伴随着子宫的感染和损伤。子宫受损甚至感染后，在各种激素和因子的调控下进行自我修复，以恢复子宫正常的结构和功能。孕酮是黄体产生的主要激素，其与雌激素共同维持雌性生殖系统的正常功能。前期研究表明，雌激素和雌孕激素联用具有促增殖作用，但单独运用孕酮对奶牛子宫内膜上皮细胞(Bovine endometrial epithelial cells，BEECs)的促增殖作用尚不明确。本试验通过体外培养BEECs，检测细胞周期、修复相关因子和通路的变化规律，揭示孕酮对BEECs增殖的影响机制，为孕酮在奶牛子宫内膜再生修复中的作用机理提供依据。
　　本试验以BEECs为研究对象，设置空白组、LPS组（1μg/mL LPS）、孕酮组(1、3、5ng/mL)和共处理组（1、3、5ng/mL孕酮+1μg/mL LPS）。作用24h后，采用CCK-8法检测细胞活性，流式细胞术检测细胞周期。结果显示:试验浓度孕酮处理或LPS处理对细胞活性均无显著影响(p＞0.05)。孕酮处理组中G1期的细胞数量减少(p＜0.01)，G2期的细胞数量增多(p＜0.01)，PI显著升高(p＜0.01)，促进细胞增殖。LPS处理组中，处于G1期的细胞显著增加(p＜0.01)，S期的细胞数量无显著变化(p＞0.05)，G2期的细胞显著减少(p＜0.01)，PI显著降低(p＜0.01)，细胞增殖水平下降。与LPS组相比，孕酮(1ng/mL)与LPS共同处理时，G1期细胞显著减少(p＜0.01)，G2期细胞显著增加(p＜0.01)，S期细胞无显著变化(p＞0.05)，整体PI显著上升(p＜0.01)，促进细胞增殖。孕酮(3ng/mL)与LPS共同处理时，G1期细胞显著减少(p＜0.01)，S期和G2期细胞数量增加(p＜0.01)，整体PI显著上升(p＜0.01)，促进细胞增殖。孕酮(5ng/mL)与LPS共同处理时，G1期细胞数量无显著变化(p＞0.05)，S期细胞显著减少(p＜0.01)，G2期细胞显著增加(p＜0.01)，PI无显著变化(p＞0.05)。
　　为研究孕酮对子宫内膜上皮细胞相关修复基因的影响，检测血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)、结缔组织生长因子(Connective tissue growth factor，CTGF)、转化生长因子-β（Transforming growth factor-β，TGF-β）、表皮生长因子受体(Epidermal growth factor receptor，EGFR)和孕酮受体(Progesterone receptor，PR)的mRNA表达。结果显示:孕酮处理3h时，上述修复相关因子和受体基因的mRNA表达无显著变化(p＞0.05)，CTGF和PR mRNA表达在18h显著下降(p＜0.01);孕酮处理12h时，上述因子和受体基因的mRNA表达，均呈现显著的升高(p＜0.01)，且有浓度依赖性，表明孕酮促进了增殖相关修复因子和受体的表达。LPS组的VEGF、TGF-β、EGFR和PR基因在3h和12h时表达普遍升高，18h降低，且CTGF表达受到抑制。说明LPS刺激细胞3h和12h后可促进相关修复因子和受体的表达，但随着时间的推移，其促进作用减弱。孕酮与LPS共处理组3h时，VEGF和PR基因表达呈现不同程度的上升，VTGF、TGF-β、EGFR呈现不同程度的下降;12h和18h时，VEGF、TGF-β、EGFR和PR均呈现不同程度的下降，但3ng/mL孕酮处理组的CTGF显著上升。这说明在LPS引发细胞损伤后，孕酮可以通过抑制部分修复因子和受体的表达，进而影响细胞的自我修复和恢复。
　　Wnt/β-catenin和PI3K/Akt通路的信号转导是细胞修复和炎症损伤的重要途径之一。本试验设置同上处理组，对该通路中相关的关键蛋白β-catenin、cyclin D1、c-Myc、PI3K、p-PI3K、Akt和p-Akt进行检测，探究孕酮对正常细胞和炎症情况下的细胞增殖和修复的影响。结果显示:β-catenin在孕酮（1ng/mL和3ng/mL）刺激下表达显著升高(p＜0.01)，在5ng/mL孕酮刺激下表达显著降低(p＜0.01)。cyclin D1和c-Myc表达均极显著升高(p＜0.01)，其中3ng/mL孕酮作用最明显;PI3K相对表达显著下降(p＜0.01)，Akt相对表达量在1ng/mL孕酮刺激下显著升高(p＜0.01)，在3和5ng/mL孕酮刺激下相对表达显著下降(p＜0.01)。说明适当浓度的孕酮可以通过激活Wnt/β-catenin通路，促进细胞的增殖，但同时孕酮也抑制了PI3K/Akt的信号转导，说明其可通过该信号转导通路，负向调控细胞的增殖分化。LPS作用细胞时，β-catenin、cyclin D1和c-Myc表达量都极显著升高(p＜0.01)，PI3K和Akt表达下降(p＜0.01)。孕酮和LPS共同处理时，β-catenin和c-Myc相对表达均下降且差异极显著(p＜0.01)。在1ng/mL孕酮刺激下cyclin D1相对表达极显著升高（p＜0.01），而3ng/mL和5ng/mL孕酮刺激cyclin D1相对表达下降且差异极显著，Wnt/β-catenin通路被抑制;PI3K显著下降(p＜0.05)，Akt不同程度上升。通过免疫荧光检测发现正常BEECs中，β-catenin主要集中在细胞膜上，孕酮和LPS作用于BEECs时β-catenin广泛分布于细胞质内，Wnt/β-catenin通路被激活。孕酮和LPS共处理时，胞质内无明显β-catenin分布，孕酮可以抑制LPS激活的Wnt/β-catenin通路。这与β-catenin蛋白结果相符。
　　综上所述，1ng/mL和3ng/mL孕酮可通过激活Wnt/β-catenin通路，促进细胞的增殖。但当炎症存在时，孕酮抑制了β-catenin和PI3K的激活，从而降低了细胞通过该通路进行自我增殖和修复，加重子宫内膜上皮细胞的损伤。这为探究奶牛子宫内膜损伤后的自我修复提供了新的思路，为奶牛子宫内膜炎的防治提供指导。

目录

摘要

符号说明

第一部分 文献综述

第一章 奶牛子宫内膜炎研究进展

1．1 奶牛子宫内膜炎

1．2 奶牛子宫的免疫机制

1．3 奶牛子宫损伤后的修复

第二章 孕酮与细胞增殖的相关研究进展

2．3 孕酮对细胞增殖的作用

第三章 Wnt／β-catenin、PI3K／Akt通路的研究进展

3．1 Wnt／β-catenin通路的研究进展

3．2 PI3K/Akt通路的研究进展

参考文献

第二部分 试验研究

2．试验方法

3．结果

4．讨论

试验二 孕酮对奶牛子宫内膜上皮细胞修复相关基因的影响

1．材料与仪器

2．方法

3．结果

4．讨论

试验三 孕酮对奶牛子宫内膜上皮细胞Wnt／β-catenin及PI3K/Akt通路的影响

1．材料

2．方法

3．结果

4．讨论

参考文献

全文结论

致谢

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