鹅MAVS介导的Ⅰ型干扰素通路激活与其抗病毒作用研究

摘要

模式识别受体(pattern recognition receptors，PRR)作为宿主细胞的天然免疫系统之中的重要组成部分，能够识别多种病原微生物，随后迅速启动宿主一系列的信号级联反应，通过合成一些细胞因子，例如Ⅰ型干扰素以及炎性细胞因子，在先天性免疫之中发挥重要的抗病毒作用。MAVS(Mitochondrial antiviral-signaling protein)作为RLR信号通路之中的关键接头蛋白，研究其对抗病毒作用的调控十分重要。目前国内尚未有鹅MAVS相关的研究报道，本文首次扩增出了鹅MAVS基因;证明鹅MAVS发挥其抗病毒作用的同时遵循种属差异性原则;通过缺失修饰鹅MAVS序列上各个结构域，分析各结构域的功能;在鹅成纤维细胞(GEF)中过表达鹅MAVS后感染新城疫病毒(NDV)，观察其对NDV复制的影响，从而综合评价鹅MAVS在抗病毒先天性免疫中所起的作用。
　　1鹅MAVS基因序列扩增与分析
　　本研究以GEF提取的总RNA为模板，利用overlap PCR方法，扩增鹅MAVS基因。序列分析表明，鹅MAVS全长2019bp，共编码673个氨基酸，10到77位氨基酸构成其CARD结构域，103到216位氨基酸构成富含脯氨酸的PRR结构域，654到673位氨基酸构成其TM结构域。将鹅MAVS克隆到PCMV3x FLAG14载体中，经SDS-PAGE分析其表达蛋白大小为72KD左右。
　　2鹅MAVS各结构域功能分析
　　通过缺失鹅MAVS中CARD结构域与TM结构域，发现下游ISGs产生减少，表明头部CARD结构域与尾部TM结构域对鹅MAVS发挥抗病毒效应的重要性;缺失PRR结构域，发现下游ISGs产生增多，表明PRR结构域对鹅MAVS发挥抗病毒效应起一定的抑制作用;缺失237位到291位氨基酸和451位到646位氨基酸这两段未知序列后，下游ISGs产生减少，表明这两段序列对鹅MAVS发挥抗病毒效应起一定的促进作用。
　　3鹅MAVS抗NDV感染作用分析
　　为了探究鹅MAVS对NDV复制的影响，我们在GEF中过表达鹅MAVS后感染NDV，选取IFITM3、MX、OASL和Viperin这4个干扰素刺激基因(ISG)与病毒NP蛋白的mRNA水平作为检测目标，发现在NDV感染早期，过表达鹅MAVS后这些ISG的mRNA水平显著升高，病毒NP的mRNA水平显著降低;在感染后期，过表达鹅MAVS后这些ISG的mRNA水平变化不大，病毒NP的mRNA水平也几乎不变。这些结果共同表明了鹅MAVS主要在NDV感染早期发挥其抗病毒作用。

目录

摘要

符号说明

第一章 文献综述

1．1 MAVS介导的抗病毒先天性免疫

1．2 线粒体介导的抗病毒先天性免疫

1．2．1 NLRP3

1．2．2 TLRs

1．2．3 NLRX1

1．2．4 IRGM

1．3 线粒体DNA对先天性免疫的调节

1．4 本研究的目的与意义

第二章 鹅MAVS相关基因的克隆及序列分析

2．1 材料

2．1．1 动物材料

2．1．2 病毒与菌株

2．1．5 主要试剂配制

2．2 方法

2．2．1 GEF的制备

2．2．2 细胞RNA的提取及反转录

2．2．3 鹅MAVS基因的扩增及其真核表达质粒的构建

2．2．4 正常鹅各组织内MAVS的mRNA水平检测

2．3 结果

2．3．1 鹅MAVS基因overlap扩增结果

2．3．2 鹅MAVS基因真核表达质粒鉴定

2．3．3 鹅MAVS基因序列分析

2．3．4 MAVS序列进化分析

2．3．5 MAVS在正常鹅体内的分布

2．4 讨论

第三章 鹅MAVS在GEF中激活干扰素信号途径

3．1．4 主要试剂配制

3．2．3 细胞内总RNA提取与Real-time PCR

3．2．4 双荧光素酶报告基因检测

3．3 结果

3．3．1 hMAVS、cMAVS和gMAVS在293T细胞中稳定表达

3．3．2 hMAVS、cMAVS和gMAVS在GEF中对其ISGs转录水平的影响

3．3．3 hMAVS、cMAVS和gMAVS在293T中对其ISGs转录水平的影响

3．3．5 hMAVS、cMAVS和gMAVS在DF-1中对鸡源IFN-β和IRF-7启动子活性的影响

3．4 讨论

第四章 鹅MAVS各功能结构域的缺失对MAVS介导干扰素通路激活的影响

4．1．3 主要仪器

4．1．4 主要试剂配制

4．2 方法

4．2．3 GEF内总RNA提取与Real-time PCR

4．2．4 免疫共沉淀(CO-IP)

4．3 结果

4．3．1 鹅MAVS基因真核表达质粒鉴定

4．3．2 △CARD、△TM、△PRR、△DM1和△DM2在GEF中稳定表达

4．3．3 gMAVS的CARD、TM和PRR区对下游ISGs转录水平的影响

4．3．4 gMAVS的DM1和DM2区对下游ISGs转录水平的影响

4．3．5 gMAVS的CARD区、TM区和PRR区对RIG-I互作的影响

4．4 讨论

第五章 鹅MAVS对新城疫病毒复制的影响

5．1．4 主要仪器

5．2 方法

5．2．1 GEF转染gMAVS质粒

5．2．2 NDV Herts／33感染GEF

5．2．3 细胞内总RNA提取与Real-time PCR

5．3 结果

5．3．2 gMAVS在GEF中对NDV NP转录水平的影响

5．3．3 gMAVS在GEF感染NDV后对下游ISGs转录水平的影响

5．4 讨论

结论

参考文献

致谢

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