自噬与细胞缝隙连接通讯在镉致大鼠肝细胞损伤过程中的作用

摘要

镉（cadmium，Cd）是环境中常见的污染物之一，能引起人及动物体多种器官的损伤。肝脏作为机体内重要的解毒器官，是镉毒性损伤的重要靶器官之一。自噬是细胞清除受损细胞器、蛋白质等的主要途径之一，对维持细胞稳态至关重要。在多细胞生物体中，细胞间存在多种交流方式，缝隙连接通讯(gap junctional intercellular communication，GJIC)是细胞间的直接通讯方式之一。研究表明，镉可引起细胞自噬水平的升高以及GJIC功能的下降，其内在机制尚未完全阐明。本试验以大鼠肝细胞系BRL3A为研究对象，建立镉损伤时间梯度模型，探究镉暴露不同时间对BRL3A细胞的自噬水平和GJIC功能的影响，以及GJIC对自噬的调控机制，为进一步阐明镉致肝细胞毒性机理提供理论依据。
　　本文主要从以下几方面进行论述：
　　1.镉对BRL3A细胞损伤的时间效应
　　为了探究镉对BRL3A细胞的毒性损伤，根据细胞实时分析技术(RTCA)呈现的5μmol/L镉对BRL3A细胞指数的影响结果，建立镉损伤细胞0h、1.5h、3h、6h、12h及24 h共6个时间段的时间梯度模型。Hoechst33258染色观察细胞核的变化，透射电镜观察细胞超微结构的变化。结果表明，与对照组相比细胞线粒体在1.5h时开始出现损伤，细胞核在3h时开始出现形态学改变，随着时间的延长，损伤程度逐渐加重，24 h内呈明显的时间-效应关系。
　　2.镉致BRL3A细胞损伤与自噬的关系
　　为了探究镉对BRL3A损伤过程中自噬的变化，利用透射电镜观察自噬体的数量、免疫荧光法观察LC3聚点现象以及蛋白免疫印迹法(Western blot)检测自噬相关蛋白的表达。结果表明，5μmol/L镉作用细胞自噬水平整体呈现先上升后下降的趋势。在细胞损伤6h时，自噬标志性蛋白LC3Ⅱ水平达到最高，差异极显著(P＜0.01)，此时添加自噬抑制剂氯喹(chloroquine，CQ)，Western blot检测自噬蛋白结果表明，与Cd及CQ单独处理组相比，CQ与Cd联合处理组的P62和LC3Ⅱ的表达水平均升高，差异显著或极显著(P＜0.05或P＜0.01)。说明镉在促进细胞自噬的同时，也引起了自噬流的阻滞。
　　3.镉致BRL3A细胞损伤与GJIC的关系
　　为探究镉对BRL3A细胞GJIC的影响，利用划痕示踪法检测GJIC的功能、免疫荧光法观察连接蛋白Cx43的分布和表达、Western blot检测GJIC相关蛋白的表达水平。结果表明，5μmol/L镉作用细胞对GJIC具有抑制作用，与镉暴露1.5 h相比，镉暴露3h时抑制减弱，Cx43蛋白表达量也相对升高，6h后Cd对GJIC抑制增强;对照组荧光聚点呈线状排列在细胞膜上，镉暴露使Cx43聚点呈团聚集并从胞膜向胞浆内转移，Cx43和p-Cx43蛋白表达水平均极显著下降(P＜0.01)。
　　为了进一步研究GJIC在镉致BRL3A细胞毒性损伤中的作用，在5μmol/LCd作用细胞6h时，添加GJIC的抑制剂18-β-甘草次酸(18-β-GA)、促进剂全反式维甲酸(ATRA)、Cx43抑制剂Dynasore和Cx43磷酸化抑制剂Ro318220，检测对GJIC相关指标的影响。结果表明，与镉单独处理组相比，联合添加ATRA能够极显著促进LY的扩散距离(P＜0.01)，促进Cx43在胞膜上的线状分布和表达，但极显著增加Cx43磷酸化蛋白的整体表达水平(P＜0.01)，降低了Cx43蛋白的表达水平(P＜0.01);联合添加GA能够极显著抑制LY的扩散距离(P＜0.01)，减少Cx43在胞膜上的分布及表达，Cx43和p-Cx43蛋白表达水平显著或极显著降低(P＜0.05或P＜0.01)。10μmol/L Dynasore能极显著抑制LY的扩散距离(P＜0.01);200nmol/LRo318220能极显著抑制LY的扩散距离(P＜0.01)，与Cd的联合处理LY的扩散距离抑制更为明显。Western blot结果表明，与Cd单独处理组相比，Dynasore与Cd的联合处理组能够极显著的降低Cx43和p-Cx43蛋白表达水平(P＜0.01);而Ro318220与Cd的联合处理组Cx43的蛋白表达水平极显著的升高(P＜0.01)，p-Cx43蛋白表达水平极显著降低(P＜0.01)。为了明确GJIC对细胞损伤的影响，延长处理时间至12h和24 h观察细胞形态，与Cd单独处理组相比，ATRA和Cd联合处理组加重细胞损伤，GA、Dynasore、Ro318220和Cd联合处理组减轻了细胞损伤。
　　以上结果说明，镉能够抑制GJIC功能，但在3h时GJIC功能会代偿性增强。镉引起GJIC的抑制与细胞质膜上Cx43的分布及表达水平密切相关，与Cx43的整体表达水平没有直接关系，但是与Cx43的磷酸化水平呈正相关。镉暴露同时，长时间抑制GJIC能够减少细胞损伤，促进GJIC能够增强细胞损伤。
　　4.镉致BRL3A细胞损伤中GJIC对自噬的影响
　　在细胞损伤6h时，添加GJIC和Cx蛋白相关促进剂和抑制剂，透射电镜观察自噬体、免疫荧光法检测LC3聚点情况、Western blot检测自噬相关蛋白表达。结果表明，与镉单独处理组相比，ATRA与Cd联合处理组自噬体数量及LC3的表达和分布减少;GA与Cd联合处理组自噬体数量及LC3的表达和分布增强;GJIC促进剂ATRA能够极显著的抑制镉致BRL3A细胞中自噬相关蛋白Atg7、Beclin-1、P62、LC3Ⅱ的表达(P＜0.01)，而抑制剂GA却相反;Cx蛋白相关抑制剂能够显著或极显著的促进Beclin-1、P62、LC3Ⅱ的表达（P＜0.05或P＜0.01），表明抑制GJIC能够促进自噬的水平，促进GJIC能够抑制镉诱导的自噬水平。

目录

摘要

缩略语表

第一部分 文献综述

第一章 镉毒性研究进展

1 镉的肝脏毒性

2 镉的毒性机理

第二章 自噬研究进展

1 自噬分类

2 自噬的诱导与调节因素

3 自噬相关蛋白的表达

4 自噬的研究进展

5 镉与自噬

6 肝与自噬

第三章 缝隙连接概述

1 缝隙连接通讯简介

2 缝隙连接蛋白

3 缝隙连接蛋白磷酸化修饰

4 缝隙连接的作用

5 缝隙连接与自噬

6 镉与缝隙连接

7 肝脏中的缝隙连接

本研究的目的和意义

第二部分 试验研究

第一章 镉对BRL 3A细胞损伤的时间效应

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

第二章 镉致BRL 3A细胞损伤与自噬的关系

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

第三章 镉致BRL 3A细胞损伤与GJIC的关系

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

第四章 镉致BRL 3A细胞损伤中GJIC对自噬的影响

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

全文结论

参考文献

致谢

攻读硕士期间发表的学术论文

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