鸡传染性法氏囊病毒VP2蛋白单克隆抗体的制备及其应用

摘要

传染性法氏囊病(infectious bursal disease，IBD)是由传染性法氏囊病毒(infectiousbursal disease virus，IBDV)引起鸡和火鸡的一种具有高度接触性的传染病。该病主要感染3-8周龄雏鸡，引起法氏囊肿大、出血、坏死及腿肌、胸肌出血等一系列病理变化，并可引起严重的免疫抑制，给全球养鸡业造成重大经济损失。VP2蛋白是IBDV的主要结构蛋白和中和抗原，目前以火鸡疱疹病毒(HVT)为载体表达VP2蛋白的重组病毒(HVT-VP2)疫苗在生产上已经得到广泛的应用。本研究成功制备了针对IBDV VP2蛋白的单克隆抗体，为IBDV的诊断和检测提供有力的工具。
　　1.VP2基因的克隆与表达
　　将IBDV SNJ93毒株接种于鸡胚绒毛尿囊膜，37℃培养72 h后收取鸡胚尿囊膜。以RNA提取试剂盒从尿囊膜中提取总RNA，作为扩增VP2基因的模板。通过RT-PCR的方法扩增出VP2基因，测序后与GenBank上发布的IBDV VP2基因序列进行比对分析，绘制进化树，确认IBDV SNJ93毒株为超强毒株。
　　用DNAStar软件对SNJ93毒株的VP2基因所推导的蛋白质氨基酸序列进行分析，选取抗原性较好且在不同毒株中相对保守的第2-57位氨基酸进行原核表达。根据对应的基因序列设计引物，采用RT-PCR扩增目的基因。将目的基因分别克隆至带有His标签的pET-32a(+)和带有GST标签的pGEX-6p-1表达载体，构建重组表达质粒pET-32a-VP2和pGEX-6p-1-VP2。将两个重组质粒分别转入表达菌株BL21(DE3)和BL21中，用IPTG进行诱导表达，SDS-PAGE电泳显示重组蛋白VP2-His和VP2-GST的大小分别为27kD和31kD。Western blot检测发现，重组蛋白VP2-His和VP2-GST均能与IBDV阳性血清反应，说明两种重组蛋白均具有良好的免疫原性。
　　2.VP2蛋白单克隆抗体的制备
　　分别以VP2-His蛋白为免疫原，VP2-GST蛋白为间接ELISA检测原，采用杂交瘤技术研制针对IBDV VP2蛋白的单克隆抗体。以VP2-His蛋白免疫BALB/c小鼠，每只小鼠的每次免疫剂量为50μg蛋白，共进行3次免疫。首次免疫用等体积的弗氏完全佐剂与VP2-His蛋白混合乳化后进行背部皮下多点注射，后续免疫均用等体积的弗氏不完全佐剂与VP2-His蛋白混合乳化进行背部皮下多点注射。经过3次免疫后小鼠血清间接ELISA抗体效价达到1∶10000以上。取免疫小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)融合。用VP2-GST蛋白包被酶标板，利用间接ELISA进行杂交瘤细胞的筛选与亚克隆检测，最终获得能稳定分泌抗VP2蛋白的单克隆抗体4株，分别命名为3B2、3C12、4A3、5A6。Westernblot分析显示，4株单克隆抗体均能与VP2蛋白特异性结合。用HVT-VP2病毒接种CEF细胞进行间接免疫荧光试验，显示4株单抗均能与感染了HVT-VP2的CEF细胞反应产生特异性荧光反应，其中3C12单抗的荧光反应最为清晰明亮。
　　3.3C12单克隆抗体在IBDV检测上的应用
　　间接免疫荧光试验(IFA)是常用的IBDV检测方法。本研究利用获得的灵敏性和特异性均较好的3C12单克隆抗体建立了检测IBDV的IFA。确定了3C12和FITC标记的羊抗鼠IgG抗体的最佳工作浓度，分别为1∶100及1∶200稀释度。用建立的IFA可对HVT-VP2疫苗进行病毒滴度的测定。将HVT-VP2疫苗用培养基进行10-1-10-10共10个稀释度稀释，分别接种于长满单层CEF细胞的96孔细胞培养板中，每个稀释度做8个重复。培养3d后进行IFA，在荧光显微镜下记录病毒噬斑数，计算病毒滴度为7×106 PFU/mL。与普通空斑计数法相比，IFA耗时较短，并且能够对HVT-VP2病毒噬斑进行更准确的计数。
　　从扬州大学动物医院采集10份疑似IBDV感染的法氏囊组织样品，将样品研磨，并加入含有1％青霉素-链霉素溶液的PBS制成混悬液，反复冻融离心后收集上清;从上清中提取总RNA，以RT-PCR检测IBDV VP2基因，发现其中8份样品为阳性。本研究探索了单克隆抗体用于琼脂扩散试验(AGPT)检测IBDV的可行性。以上述8份RT-PCR检测阳性的样品为待检抗原，与3C12单抗进行AGPT，并以IBDV阳性血清作为对照。结果表明，单抗与阳性血清的检测结果相符。由于单抗具有来源稳定、质量均一等优点，因此在AGPT中可以取代阳性血清。

目录

摘要

符号说明

第一章 传染性法氏囊病毒的研究进展

1 IBD的病原学特征

2 IBDV的进化

2．1 选择压力

2．2 同源重组

3 IBDV的基因组结构及蛋白组的研究

3．1 IBDV的基因组结构

3．2 IBDV蛋白组的研究

4 传染性法氏囊病检测技术

4．1 血清学和免疫学技术

4．2 分子生物学技术

5 单克隆抗体技术在IBDV研究上的应用

5．1 IBDV的检测

5．3 IBDV的防治

第二章 鸡传染性法氏囊病毒VP2蛋白单克隆抗体的制备及其应用

1 材料

1．1 载体与菌株

1．4 主要试剂的配制

1．5 主要实验仪器

2 方法

2．1 VP2蛋白的原核表达

2．2 VP2蛋白单克隆抗体的制备

2．3 VP2蛋白单克隆抗体的应用

3 结果

3．1 VP2蛋白的表达

3．2 VP2蛋白单克隆抗体的制备

3．3 VP2蛋白单克隆抗体的应用

4 讨论

全文总结

参考文献

致谢

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