水稻抗、感稻瘟病材料鉴定技术体系研发、集成与应用

摘要

稻瘟病是限制水稻高产的主要病害之一。由于稻瘟病菌生理小种的易变性，所推广的抗稻瘟病品种常常在种植不久之后就丧失其抗病性，导致其失去使用价值。因此，快速、有效地筛选和利用优良的抗稻瘟病品种一直是国内外研究重点。其中，抗稻瘟病基因分子鉴定是水稻抗稻瘟病材料辅助选择的重要方面。针对目前抗稻瘟病基因分子鉴定主要是以DNA为模板定性检测水稻中抗性基因的有无及组成，不能鉴定抗稻瘟病功能基因是否表达的不足，本文以水稻所含的稻瘟病抗性基因（已被克隆，且为江苏省水稻品种的主要抗病基因）为对象，集成和研发了抗稻瘟病功能基因组成、表达鉴定和病菌接种鉴定技术体系。主要研究结果如下:
　　1.稻瘟病菌的培养及接种方法比较
　　本实验首先对所收集和保存的稻瘟病菌进行培养，获得稻瘟病菌孢子液。在此期间对水稻进行培养，于三叶一心期分别用喷施法、创伤法、诱发法进行稻瘟病菌接种，结果表明，创伤法对水稻伤害较大，易造成水稻枯萎，影响结果。所以喷施法接种相对较好。
　　2.抗稻瘟病基因鉴定方法的研发、集成与应用
　　利用水稻稻瘟病抗性基因的分子标记，研发了同时检测稻瘟病抗性基因Pikh与Pil的多重PCR体系，集成了同时检测稻瘟病抗性基因Pita与Pib的多重PCR体系。由于Pikm是由两个紧密连锁的具有独立功能NBS-LRR类基因组成，故建立了分别检测Pikm1-TS和Pikm2-TS两个片段的Pikm基因鉴定方法。并用这两套体系和Pikm基因鉴定方法对江苏润扬种业股份有限公司所选育的114份杂交后代水稻材料中的抗病基因Pita、Pib、Pikh、Pil和Pikm进行了检测，以确定这些杂交后代水稻材料中抗稻瘟病基因的分布情况。
　　检测结果表明，114份材料中含抗稻瘟病基因Pita的有81份，含Pib的有106份，含Pikh的有35份，含Pikm的有13份，含Pil的仅有3份。分别占检测材料的71.0％、92.9％、30.7％、11.4％、2.6％，表明了Pib、Pita和Pikh这三个抗稻瘟病基因广泛存在于江苏润扬种业股份有限公司所选育的杂交后代水稻材料中。这可能与该公司在杂交配组时注重对抗稻瘟病亲本的选择和选育过程中长期注重对稻瘟病抗性的筛选有关。
　　3.水稻对穗颈瘟抗性的稻瘟病菌接种鉴定
　　对田间水稻进行稻瘟病菌接种，接种7d后进行病情调查。穗颈瘟接种鉴定结果表明:114份材料中经人工接种鉴定表现为高抗的有2份，抗病的有27份，中抗的有32份，感病的有33份，高感的有20份。分别占鉴定总数的1.7％、23.7％、28.1％、28.9％、17.5％。抗稻瘟病基因和穗颈瘟抗性之间的相关性分析表明:Pita、Pikh基因与穗颈瘟的抗性呈显著(P＜0.05)的正相关，相关系数分别为0.297、0.239。Pib Pil和Pikm基因与穗颈瘟的抗性之间相关性不显著。
　　4.水稻对稻瘟病抗性的基因表达评价
　　本试验针对多数育种单位不具备配备荧光定量PCR仪的实际情况，研发了抗稻瘟病基因表达水平的半定量RT-PCR便捷检测技术。以Ubq5为内参，选择Pib、Pita和Pikh为抗性基因进行检测。在所抽检的11个材料中，尽管Pita基因是组成型表达，但经检测发现在抗稻瘟病材料中该基因的表达仍然受到稻瘟病菌接种的诱导。Pikh和Pib基因是诱导型表达，稻瘟病菌接种后Pikh和Pib基因在抗稻瘟病材料中上调表达，而在感稻瘟病材料中Pikh和Pib基因均明显下调表达。这表明，在抗稻瘟病水稻材料中抗稻瘟病基因Pib、Pita和Pikh的表达受到稻瘟病菌接种处理的诱导，而在感稻瘟病水稻材料中这种表达诱导作用不明显，甚至Pikh和Pib基因出现表达下调。这一方面说明，抗稻瘟病基因表达水平可用于对含有抗稻瘟病主效基因水稻品种的抗性评价，另一方面说明，瘟病菌接种处理后抗稻瘟病基因的差异表达能更合理解释在生产上某些含有抗稻瘟病主效基因的水稻品种其抗性经常表现不理想的现象。
　　5.水稻受稻瘟病侵染标志基因预测方法的建立
　　根据转录组学检测结果，筛选出一个有可能作为一个水稻是否受到稻瘟病侵染的标志基因(Barwin)，经本文所研发的半定量RT-PCR检测发现，不管在抗稻瘟病材料还是感稻瘟病材料中Barwin基因均随稻瘟病菌接种时间的推移其表达量逐步升高。因此，可通过检测Barwin基因表达水平随时间的变化来预测特定品种或特定田块的水稻是否受到稻瘟病侵染。
　　6.感稻瘟病材料标志基因表达鉴定方法的建立
　　根据转录组学检测结果，筛选出两个有可能作为感稻瘟病水稻材料鉴定的标志基因，即与防御相关的几丁质酶3和葡聚糖内切-β-1，3-葡萄糖苷酶基因。据此，本文设计引物并建立了这两个基因表达水平的半定量RT-PCR检测方法。检测结果发现，这两个基因的表达在感稻瘟病水稻材料中受到稻瘟病菌接种的显著诱导，在抗稻瘟病材料中未见表达或者表达量很低。因此，可以通过检测这两个基因在稻瘟病菌接种条件下的表达水平鉴别某水稻材料是否为感稻瘟病材料。

目录

摘要

主要名词缩写

1 文献综述

1．1 稻瘟病的研究概况

1．1．1 稻瘟病菌

1．1．2 稻瘟病的危害

1．1．3 稻瘟病菌的多样性

1．1．4 稻瘟病的防治

1．2 水稻抗稻瘟病基因的研究

1．3 水稻抗稻瘟病免疫系统

1．3．1 PAMPs介导的水稻PTI免疫反应

1．3．2 效应分子诱导的免疫反应

1．3．3 非效应因子型蛋白介导的水稻感病反应

1．4 水稻抗稻瘟病育种

1．4．1 分子辅助标记育种

1．4．2 基因工程抗病育种

1．5 本研究的目的与意义

2．1．1 供试水稻材料

2．1．2 供试病菌材料

2．1．3 主要实验试剂

2．1．4 主要实验仪器

2．2 实验方法

2．2．1 稻瘟病菌的培养

2．2．2 供试水稻培养

2．2．3 稻瘟病菌接种方法的比较

2．2．4 水稻穗颈瘟的接种与鉴定

2．2．5 抗稻瘟病基因鉴定方法研发、集成和应用

2．2．6 水稻对稻瘟病抗性的基因表达评价

2．2．7 水稻受稻瘟病侵染标志基因预测方法的建立

2．2．8 感稻瘟病水稻材料标志基因鉴定方法的建立

2．3 数据分析

3 结果与分析

3．1 稻瘟病菌的培养

3．2 稻瘟病菌接种方法的比较

3．3 水稻抗稻瘟病基因的多重PCR检测

3．4 水稻抗稻瘟病基因Pikm的检测

3．5 水稻穗颈瘟的抗性鉴定

3．6 水稻稻瘟病抗性与抗病基因的相关性分析

3．7 水稻对稻瘟病抗性的抗性基因表达评价

3．7．2 抗稻瘟病基因表达水平的半定量RT-PCR检测

3．8 水稻受稻瘟病侵染标志基因预测方法的建立

3．9 感稻瘟病材料标志基因鉴定方法的建立

4 讨论

4．1 抗性基因鉴定方法研发、集成与应用

4．2 水稻穗颈瘟的抗性鉴定分析

4．3 水稻对稻瘟病抗性的基因表达与抗性间的评价

4．4 水稻受稻瘟病侵染标志基因鉴定

4．5 感稻瘟病材料标志基因鉴定

5 结论

参考文献

致谢

攻读硕士期间发表论文

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