沙门菌O9抗原单克隆抗体竞争ELISA试剂盒的研制及初步应用

摘要

禽沙门菌病(Avian salmonellosis)是禽感染沙门菌(Salmonella)后引起的一系列急性或慢性疾病的统称。鸡群中沙门菌的感染不仅可以引起雏鸡的死亡，也会引起成年鸡产蛋能力的下降，直接对养禽业造成重大的经济损失。除此之外，食用被沙门菌感染鸡群所生产的禽类制品也是人类感染沙门菌的重要途径之一，对人类的健康构成了巨大的威胁。现代规模化养鸡场，主要以鸡白痢沙门菌(Salmonella enterica serovar Pullorum)和肠炎沙门菌(Salmonella enterica serovar Enteritidis)的感染为主。鉴于沙门菌所带来的巨大危害，中国于2012年启动的《国家中长期动物疫病防治规划（2012年-2020年）》中明确指出将沙门菌病的防控作为优先防治的二类动物疫病，并提出到2020年中国种鸡场实现沙门菌病净化的目标。为实现种鸡场沙门菌病的净化目标，拥有灵敏、准确、快速的沙门菌病诊断方法是必不可少的。
　　玻板凝集试验(Plate agglutination test，PAT)是国内普遍采用的禽类沙门菌抗体快速检测方法，但是PAT试验敏感度差，特异度低，时常出现假阳性的检测结果，这对禽沙门菌病的诊断构成了极大的困扰。酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)被认为是敏感特异的实验室抗体检测方法之一。本研究以沙门菌O9抗原单克隆抗体为基础，研制出的用于禽类沙门菌诊断的竞争ELISA试剂盒相比传统的PAT检测方法具有更高的特异性和敏感性，有望成为禽沙门菌血清学诊断方法之一。
　　1沙门菌O9抗原单克隆抗体竞争ELISA方法的建立
　　本研究以本室前期研制的3-47-0杂交瘤细胞制备单克隆抗体腹水，并进行纯化和HRP标记，获得酶标抗体的效价达到51，200以上。采用热酚水法提取了鸡白痢沙门菌的LPS作为包被抗原，并通过蒽酮比色法测定其浓度为484.31μg/mL。竞争ELISA反应条件的摸索采用棋盘法，确定抗原的包被浓度为320ng/mL，酶标抗体的使用浓度为41.6ng/mL，待测血清的稀释度为1∶4。在对竞争ELISA优化后，确定了抗原包被的条件为4℃，24h，酶标单抗作用条件为37℃，2h，底物作用条件为37℃，3min。最终该竞争ELISA方法检测肠炎沙门菌阳性血清的抑制率可达89％，检测鸡白痢沙门菌阳性血清的抑制率可高达94％。同时，本竞争ELISA方法在检测大肠杆菌、奇异变形杆菌阳性血清时，抑制率均小于10％，呈现明显的阴性反应。
　　2沙门菌O9抗原单克隆抗体竞争ELISA试剂盒的组装及初步应用
　　竞争ELISA方法优化后，本研究组装了用于检测禽沙门菌O9抗体的竞争ELISA检测试剂盒。本试剂盒通过ROC曲线法确定检测试剂盒的阴阳性临界值，即抑制率＞38％为阳性，在此检测标准下，试剂盒的特异性达到99.7％，敏感度到达96.2％。该试剂盒通过使用Proclin300防腐抑菌剂和HRP保护剂，有效解决了ELISA试剂盒的储存问题，使ELISA试剂盒在4℃保存条件下的有效期达到3个月，并保持良好的检测效果(C.V=1.37)。该竞争ELISA试剂盒有良好的稳定性，试剂盒的批内和批间差异均较小，其变异系数分别为6.84％和9.30％;经过不同操作者对同一批血清样品进行检测（双盲试验），不同操作者之间的检验结果符合率达到100％;与同类型商品化试剂盒比较结果显示，与法国ID.vet公司的D群沙门菌抗体检测试剂盒相比，检测结果的符合率达到98.1％，而与传统的PAT试验相比，检测结果的符合率为88％。应用本竞争ELISA试剂盒检测免疫过鸡白痢减毒活疫苗SKLZS06004ΔspiC的鸡血清，最早于第21天便可以检测出阳性结果，并且在56天后血清中LPS的抗体仍保持在较高水平。应用本竞争ELISA试剂盒检测来自江苏、山东、河北三个地区的三个不同种鸡场的776份血清样品时，测得平均阳性率为14.04％，其中河北某种鸡场的阳性率最低，为5.57％。

目录

摘要

符号说明

文献综述 沙门菌检测方法的研究进展

第一章 沙门菌O9抗原单克隆抗体竞争ELISA方法的建立

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

参考文献

第二章 沙门菌O9抗原单克隆抗体竞争ELISA试剂盒的组装及初步应用

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

参考文献

致谢

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