日粮淀粉来源与有机酸预处理玉米对奶山羊瘤胃酸中毒的影响及机制

摘要

亚急性瘤胃酸中毒(Subacute ruminal acidosis，SARA)是集约化条件下反刍动物常见的营养代谢病，通常以高精料状态下大量淀粉在瘤胃的快速发酵导致的瘤胃pH快速下降为诱因，同时伴随着消化道有害物质如脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）的大量释放和易位，进而造成机体的炎症反应。在生产上，SARA不仅伴随许多其他营养代谢病，危害动物健康，而且导致生产性能的下降。围绕SARA的预防，前人做了多种研究，本研究首先通过动物试验验证降低谷物的瘤胃降解率能够有效的缓解SARA，进而通过体外研究筛选出能够降低瘤胃降解率的谷物处理方法，通过在体试验证明该处理能够有效预防SARA，全文分5个部分。 试验一、不同淀粉来源和水平的日粮对奶山羊瘤胃发酵和炎症反应的影响 试验选取8只泌乳中期的初产萨能奶山羊（体重35±3.1 kg，泌乳天数140±8.2天）随机分为4组，采用有重复的2×2因子的4×4拉丁方设计，日粮处理分别为玉米基础的低淀粉日粮、玉米基础的高淀粉日粮、小麦基础的低淀粉日粮和小麦基础的高淀粉日粮。每个试验期为24天，其中21天的适应期和3天的采样期。相对于玉米日粮，小麦日粮显著增加(P＜0.05)了瘤胃pH低于5.6的时长，提高了（P＜0.05）瘤胃LPS浓度，但是粪便LPS的浓度却有所降低(P＜0.05)。而两种不同淀粉来源的日粮对瘤胃pH（包括pH的平均值、最小值和最大值）、挥发性脂肪酸(volatile fatty acids，VFA)以及乳酸浓度均没有影响。相对于低淀粉日粮来说，高淀粉日粮显著降低了(P＜0.05)瘤胃pH，并提高了（P＜0.05）瘤胃VFA和乳酸浓度，同时提高（P＜0.05）了瘤胃和粪便脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）浓度。淀粉来源对奶山羊的干物质采食量、产奶量和乳成分都没有影响，而相对于低淀粉日粮，高淀粉日粮提高(P＜0.05)了产奶量、乳糖产量和泌乳效率。小麦日粮相对于玉米日粮显著提高了（P＜0.05）血液中钟声样受体4的浓度，而高淀粉日粮相对于低淀粉日粮则显著提高了(P＜0.05)血清淀粉样蛋白A、触珠蛋白、LPS结合蛋白和血液LPS浓度。通过计算皮尔逊相关系数发现，瘤胃LPS浓度与血液中血清淀粉样蛋白A、触珠蛋白、LPS结合蛋白、TLR-4的浓度以及乳中的体细胞数均有显著相关(P＜0.05)，而粪便LPS浓度与这些炎性指标均无显著相关。因此本研究认为高淀粉日粮会增加SARA风险，而降低谷物的瘤胃降解率可能是一种预防SARA的潜在方法。 试验二、不同淀粉来源和水平的日粮对奶山羊瘤胃微生物菌群的影响 将试验一中奶山羊在每一期第24天早饲前采集的瘤胃液和瘤胃内容物均匀混合，提取DNA，进行高通量测序。结果发现，日粮来源对有效Tag和优化Tag数都没有影响，但是小麦日粮显著降低了(P＜0.05) OTU数;高淀粉日粮相对于低淀粉日粮来说，其有效Tag和优化Tag数均有所提高(P＜0.05)，但是OTU数目却显著降低。通过对细菌门水平进行分析，发现淀粉来源和浓度对山羊门水平的微生物区系没有交互作用，小麦日粮显著提高了瘤胃中蓝藻菌门(Cyanobacteria)的比例(P＜0.05)，且有提高拟杆菌门(Bacteroidetes)和放线菌门(Actinobacteria)比例以及降低Candidate division TM7比例和互养菌门(Synergistetes)比例的趋势(P＜0.10)，并有提高拟杆菌门(Bacteroidetes)和厚壁菌门(Firmicutes)比值的趋势(P＜0.10);高淀粉浓度相对于低淀粉浓度日粮显著降低了（P＜0.05）奶山羊瘤胃拟杆菌门(Bacteroidetes)、变形菌门(Proteobacteria)、柔壁菌门(Tenericutes)、Candidate division SR1以及未鉴定出的细菌(Unclassified)的比例和拟杆菌门和厚壁菌门的比值，并有降低互养菌门(Synergistetes)比例的趋势（P＜0.10），而增加了（P＜0.05）厚壁菌门(Firmicutes)和广古菌门(Euryarchaeota)比例，并有增加Candidate division TM7比例的趋势(P＜0.10)。对细菌属水平的分析发现，相对于玉米日粮，小麦日粮显著增加了(P＜0.05)瘤胃中普雷沃氏菌（Prevotella）、Unclassified Gastranaerophilales和Quinella的比例，并有增加丁酸弧菌（Butyrivibrio）、Unclassified Veillonellaceae和新月单胞菌（Selenomonas）的趋势（P＜0.10），但却显著降低了(P＜0.05)Unclassified Ruminococcaceae、RC9gut group、Unclassified Lachnospiraceae、Incertae Sedis和Unclassified Erysipelotrichaceae的比例;相对于低淀粉日粮，高淀粉日粮显著增加了(P＜0.05)UnclassifiedRuminococcaceae、Unclassified Christensenellaceae、Unclassified BS11 gut group、RC9 gutgroup、Butyrivibrio、Unclassified S24-8、Methanobrevibacter、Incertae Sedis、Saccharofermentans、Unclassified Erysipelotrichaceae和Quinella的比例，但是显著降低了普雷沃氏菌（Prevotella）、Unclassified Prevotellaceae、Unclassified RF16、Succiniclasticum、 Unclassified RF17和Selenomonas的比例。门水平的相关分析发现瘤胃LPS浓度与厚壁菌门比例有显著的正相关（r=0.5;P＜0.05），而属水平的相关分析则发现Christensenellaceae和Quinella两个属均与瘤胃LPS浓度有显著正相关(r=0.66，0.62;P＜0.05)。因此，本研究认为拟杆菌门大量降低和厚壁菌门的大量增殖可能是高谷物诱导SARA的一大特征，而SARA期间瘤胃LPS的大量释放可能与瘤胃厚壁菌门的大量增殖有关，且Christensenellaceae属和Quinella属在SARA期间的大量增殖可能是造成瘤胃LPS大量释放的原因。 试验三、不同有机酸处理对缓解亚急性瘤胃酸中毒作用效果的研究 本研究用水、0.5％、1％和5％的乳酸、柠檬酸和磷酸分别在室温和55℃条件下浸泡玉米淀粉48小时，随后将处理过的淀粉分别与过1-mim筛的粉碎羊草以7∶3和3∶7两种比例混合制备高淀粉底物和低淀粉底物进行体外发酵。结果发现低淀粉底物组不同酸种类对发酵液pH、乳酸浓度和总VFA浓度都没有影响，而酸浓度为5％的处理组相对于其他处理浓度显著降低了（P＜0.05）发酵液的pH水平，但对发酵液中乳酸和VFA浓度没有影响。高淀粉底物组中，柠檬酸处理显著提高了(P＜0.05)发酵液的pH水平，且有降低发酵液中VFA和乳酸浓度的趋势(P＜0.10)。处理的酸浓度为0.5％和1％时发酵液pH虽然相对于对照组没有提高，但是却显著高于(P＜0.05)酸浓度为5％的处理组，而总VFA浓度则明显高于(P＜0.05)对照组和酸浓度为5％的处理组。加热处理不管对发酵液pH、乳酸浓度还是VFA浓度都没有差异。通过电镜图片发现处理的酸种类和加热处理对淀粉结构都没有影响，但是当处理的酸浓度为5％时，淀粉表面空洞结构明显增多，这可能意味着处理的酸浓度为5％时会导致淀粉一定程度的酸解，破坏了淀粉的空间结构。本研究证明0.5％和1％的柠檬酸处理能够有效增加淀粉的瘤胃发酵抗性。 试验四、柠檬酸处理玉米缓解反刍动物亚急性瘤胃酸中毒的最佳工艺筛选 将过2-mm筛的粉碎玉米分别在等体积（wt/vol）的水、0.5％和1％的柠檬酸中浸泡12、24或者48小时。处理过的玉米用于体外培养，分别测定发酵6小时和24小时的产气量、VFA浓度、氨氮浓度以及干物质消失率(Dry matter disappearance，DMD)。使用3头高精料饲喂的瘤胃瘘管肉牛作为瘤胃液供体。肉牛日粮包含30％的大麦青贮、67％的干压大麦和3％的预混料（干物质基础）。处理的酸浓度和浸泡时间对于玉米的营养成分、产气动力学、DMD、发酵指标和气体成分没有交互作用。结果发现相对于对照组，柠檬酸处理组的抗性淀粉(Resistance starch，RS)含量明显升高(P＜0.05)，但是0.5％和1％处理之间没有差异。可溶性淀粉随着浸泡时间的缩短而升高，浸泡12小时的样品中最高(P＜0.05)，24小时的次之(P＜0.05)，而浸泡48小时的样品中最低(P＜0.05)。浸泡48小时的样品相对于浸泡了12小时和24小时的样品，RS浓度明显升高(P＜0.05)，而浸泡12小时和24小时的样品之间没有差异。发酵24小时后，柠檬酸浓度为0.5％和1％的处理组的积渐产气量、产气速率、VFA浓度、氨氮浓度和DMD都显著低于(P＜0.05)对照组。但是除了1％浓度组的产气速率低于（P＜0.05）0.5％组外，两种不同柠檬酸浓度处理对其他指标无显著差异。体外发酵24小时后，浸泡12小时组的产气速率、DMD和氨氮浓度均最高(P＜0.05)，浸泡24小时的次之(P＜0.05)，而浸泡48小时的最低(P＜0.05)，但是浸泡24或者48小时的样品其发酵液VFA浓度没有差异。柠檬酸处理组的乙丙比显著高于(P＜0.05)对照组，且浸泡24和48小时组的乙丙比相对于浸泡12小时组也显著提高(P＜0.05)。柠檬酸处理和浸泡时间的延长都显著降低了(P＜0.05)甲烷和CO2的产量。本研究结构证明柠檬酸处理能够有效增加玉米中RS的比例，将发酵模式从丙酸型向乙酸型转变，同时降低瘤胃DMD，因此柠檬酸处理能够有效降低瘤胃淀粉降解率，有缓解SARA的潜力，而0.5％的柠檬酸浸泡48小时可能是降低玉米瘤胃降解率的有效方法。 试验五、饲喂柠檬酸处理的玉米对奶山羊瘤胃酸中毒发生和机体炎症反应调控作用 本试验选用8只有瘤胃瘘管的萨能奶山羊，采用交叉试验设计，每个试验期21天，其中14天的适应期和7天的采样期。山羊饲喂精粗比7∶3的高精料日粮，，其中玉米含量为60％。山羊日粮中的玉米分别浸泡在等量的水或者0.5％的柠檬酸中48小时。结果发现，柠檬酸处理组的山羊瘤胃pH（平均pH和pH的最小值）显著提高（P＜0.05），瘤胃pH低于5.6的时长以及低于5.6、5.8和6.0的面积显著降低(P＜0.05)。柠檬酸处理组的瘤胃总VFA浓度和丙酸的摩尔浓度均显著降低(P＜0.05)，而乙酸的摩尔浓度显著升高(P＜0.05)。相对于对照组，柠檬酸处理组的山羊瘤胃LPS浓度显著降低（P＜0.05），且瘤胃乳酸浓度也有降低的趋势(P＜0.10)。柠檬酸处理对干物质采食量、实际乳产量、乳蛋白产量和乳糖产量都没有影响，但是有提高乳脂产量和乳脂校正乳产量的趋势(P＜0.06)。对免疫指标来说，虽然外周血的LPS浓度没有显著变化，但是柠檬酸组的血液触珠蛋白和肿瘤坏死因子的浓度都有显著降低（P＜0.05），而LPS结合蛋白和血清淀粉样蛋白A的浓度也有降低的趋势(P＜0.10)。这些结果意味着饲喂柠檬酸处理的玉米能够有效地提高瘤胃pH水平，降低SARA风险，并能减弱炎症反应，同时还有提高乳脂产量和乳脂校正乳产量的趋势。

目录

论文说明

摘要

本文部分缩略词的中英文对照

第一章文献综述

引言

1．1亚急性瘤胃酸中毒的发病率及我国的现状

1．2亚急性瘤胃酸中毒的产生机制

1．3亚急性瘤胃酸中毒的诊断

1．4亚急性瘤胃酸中毒的危害

2．亚急性瘤胃酸中毒发病的微生物学机制和主要的毒性代谢物的易位

2．1亚急性瘤胃酸中毒对瘤胃微生物菌群的影响

2．2瘤胃主要毒性物质的产生

2．3毒性成分向血液的易位

3．日粮碳水化合物组成和结构对反刍动物生产性能和消化道健康的影响

3．1碳水化合物的结构及其在反刍动物消化道中的消化

3．2碳水化合物对动物生产性能的影响

3．3碳水化合物对消化道健康的影响

4．谷物饲料中淀粉在反刍动物消化道中的消化和利用

4．1谷物淀粉含量和分布

4．2谷物淀粉在反刍动物消化道中的主要消化部位

4．3影响谷物淀粉消化率的主要因素

5．日粮能量中淀粉数量和结构与亚急性瘤胃酸中毒的关系

5．1日粮淀粉数量对亚急性瘤胃酸中毒的影响

5．2日粮淀粉结构对亚急性瘤胃酸中毒的影响

6．能量饲料加工处理降低瘤胃降解率

6．1物理方法

6．2化学方法

7．酸处理能量饲料原料的研究进展

7．1乳酸

7．2单宁酸

7．3柠檬酸

8．研究目的、意义和内容

8．1研究目的和意义

8．2试验假设

8．3研究内容

8．4技术路线

第二章试验研究

1．材料方法

2．结果

3．讨论

4．小结

试验二、不同淀粉来源和水平的日粮对奶山羊瘤胃微生物菌群的影响

1．材料方法

2．结果与讨论

3．小结

试验三、不同有机酸处理淀粉对缓解亚急性瘤胃酸中毒作用效果的研究

1．材料方法

2．结果

3．讨论

4．小结

试验四、采用柠檬酸处理玉米缓解反刍动物亚急性瘤胃酸中毒的最佳工艺筛选

1．材料和方法

2．结果

3．讨论

4．小结

试验五、饲喂柠檬酸处理的玉米对奶山羊瘤胃酸中毒发生和机体炎症反应调控作用

1．材料方法

2．结果

3．讨论

4．小结

第三章全文讨论和结论

1．全文讨论

1．1亚急性瘤胃酸中毒与谷物瘤胃降解率的关系

1．2有机酸处理对玉米瘤胃降解率的影响

1．3柠檬酸处理玉米对奶山羊高精料状态诱导的亚急性瘤胃酸中毒的缓解作用

2．全文结论

3．创新点

4．今后需深入研究的内容

参考文献

致谢

攻读学位期间发表的论文、著作和报告

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