纤溶系统的调控及溶栓剂的分子生物学研究

摘要

血栓性疾病,尤其是急性心肌梗塞(AMI)和缺血性脑梗塞严重威胁着人类的健康,是人类致死、致残的首要原因.在发生AMI后尽早应用溶栓剂进行治疗,能显著降低AMI死亡率,改善预后.但是,现有的溶栓剂还存在着多种缺陷,如出血、缺血心肌没有明显的再灌注,以及溶栓治疗性再梗塞.因而对纤溶系统及其调节机制的研究,以及对高效、安全、方便的溶栓剂的研制具有重要作用,是该领域的研究重点.该文围绕纤溶系统的调控机制和溶栓剂DSPA进行了一系列研究.首先利用大鼠肺纤维蛋白沉积模型,研究PAI-1和TAFIa对纤溶的调控作用;再从分子生物学及生物化学的角度探讨新型纤溶剂DSPA(Desmodus rotundus salivary plasminogen activator)的作用机制;最后研制P-selectin导向的DSPA,试图得到一个更好的溶栓剂.新鲜动脉血栓主要由活化血小板和纤维蛋白组成,而陈旧性止血血栓主要由纤维蛋白组成.P-selectin是活化血小板的标志物,是新鲜动脉血栓导向的良好靶抗原.该室于1989年研制了抗活化血小板表面P-selectin的单克隆抗体SZ51,研究显示它具有很好的血栓显像效果.另外,SZ51导向的单链uPA(SZ51sucPA)在体内外溶栓实验中也显示出比uPA更好的溶栓作用.为研制P-selectin导向的DSPA,我们构建了全长SZ51-DSPA、SZ51Fab'-DSPA和SZ51scFv-DSPA的表达载体,并根据它们所表达的融合蛋白的抗原结合特性和溶栓能力,从中选出SZ51-DSPA作进一步研究;建立了4株高效表达SZ51-DSPA(>3ug/ml)的稳定表达细胞株;经protein A亲和柱和凝胶柱分离后得到了纯化的融合蛋白;纯化的SZ51-DSPA与SZ51抗体具有相同的抗原结合特异性,两者的kd值类似.体外溶栓实验显示SZ51-DSPA与DSPA具有同等的溶栓作用.这些结果显示,我们成功地研制了P-selectin导向的DSPA,它保留了SZ51的抗原结合特性和DSPA溶栓功能.下一步我们将采用狗的股动脉血栓模型进行溶栓试验,以明确SZ51-DSPA在动物体内是否优于DSPA本身.

目录

文摘

英文文摘

第一章：人体纤溶系统概述及研究进展

人体纤维蛋白溶解系统概述

纤溶系统调控机制研究进展

溶栓剂研究进展

第二章：PAl-1和TAFla对大鼠内源性纤溶的调节作用

材料与方法

结果

1、建立大鼠肺纤维蛋白沉积模型

2、PAI-1对Batroxobin导致的大鼠肺纤维蛋白沉积模型的影响

3、LPS的作用

4、TAFla在大鼠肺纤维蛋白沉积模型中的作用

讨论

第三章：DSPA作用机制的研究

第四章：研制P-selectin导向的DSPA

材料与方法

结果

1、表达载体的构建

2、融合蛋白的表达及性质鉴定

3、建立稳定表达细胞株

4、SZ51-DSPA的生产及纯化

5、SA51-DSPA的特性鉴定

讨论

第五章：结论

参考文献

三年期间发表与待发表的文章

致谢