mIL-10基因转染修饰骨髓间充质干/祖细胞在H-2单倍型骨髓移植aGVHD模型中的免疫生物学研究

摘要

目的：①小鼠骨髓间充质干/祖细胞体外培养体系的优化及相关生物学研究；②mIL—10重组复制缺陷型腺病毒载体的构建制备及转染mMSC/MPC表达；③mIL—10基因转染修饰骨髓间充质干／祖细胞在H—2单倍型骨髓移植aGVHD模型中的生物免疫学效应。 方法：⑴无菌剥离SPF级雌性C57BL/6小鼠股骨与胫骨，以培养基反复强力冲洗并刮擦髓腔内膜后收集冲洗液，加入碎骨片振荡冲洗，过200目滤网制备为单细胞悬液。分别以3种完全培养基（低糖DMEM完全培养基，低糖DMEM/MCDB201完全培养基，Mesencult完全培养基）重悬，以1×106/c㎡的密度接种于25c㎡滤膜培养瓶，转细胞培养箱，37℃，5% CO2，100%饱和湿度条件下培养。24小时后全量换液，去除未贴壁细胞，此后每3日换液一次。镜下贴壁细胞约70%—80%汇合时消化，以2．5～5×103/c㎡密度接种传代。对不同代数的培养细胞进行如下检测：倒置显微镜下形态学特点观察；不同培养体系小鼠成纤维细胞样集落形成单位（CFU—F）的检测；计数绘制细胞生长曲线及倍增时间；流式细胞仪细胞周期检测；流式细胞仪检测细胞表面标记；体外定向诱导向成骨、成脂肪分化，鉴定多向分化潜能；RT—PCR法检测细胞mIL—10mRNA；双抗体夹心ELISA法检测细胞培养上清中mIL—10。采用SPSS11．5 FOR WINDOWS统计处理软件分析，检验水准α=0．05。⑵以pORF5—mIL—10质粒为模板，PCR扩增回收mIL—10 cDNA，经一系列酶切和连接反应，将其定向插入腺病毒载体pSGCMV中，构建pSGCMV—mIL10质粒；此质粒与5型腺病毒质粒pBGHE3通过脂质体Lipofectamine2000共转染HEK293细胞，经胞内同源重组产生重组复制缺陷型腺病毒Ad5—mIL—10；经纯化后的Ad5—mIL—10在HEK293细胞中大量扩增，并通过氯化铯密度梯度离心法纯化，制备病毒液，50%组织培养感染剂量法（TCID50）测定病毒滴度；以Ad5—EGFP腺病毒确定转染mMSC/MPC的最宜感染复数（MOI），Ad5—mIL10腺病毒体外转染mMSC/MPC；RT—PCR法检测Ad5—mIL10转染mMSC/MPC后mIL10的mRNA表达，ELISA法检测Ad5—mIL10转染mMSC/MPC培养上清中mIL—10。⑶以雌性C57BL/6小鼠为供鼠，雄性F1（CB6F1）小鼠为受鼠，建立H—2单倍型骨髓移植aGVHD模型：对受鼠进行直线加速器6mvX射线一次性全身照射，总剂量12Gy，剂量率100cGy/min。制备供鼠1：0，1：1，1：2，1：3四种比例的骨髓单个核细胞（MNC）／脾MNC混合悬液（骨髓MNC取1×107/只），每比例为一实验组（n=15）。受鼠于照射后4小时内经尾静脉回输相应混合悬液，移植后进行一般情况观察，定期体重监测、外周血象及嵌合体测定，GVHD临床综合评分，组织病理学半定量评分，以综合评判各组aGVHD效应，最终确定引出理想aGVHD状态的相关参数，建立H—2单倍型骨髓移植aGVHD模型；选择1×105/只和5×105/只两个剂量梯度作为MSC/MPC移植剂量，在H—2单倍型骨髓移植aGVHD模型中，分别以MSC/MPC及mIL—10基因转染修饰的MSC/MPC进行共移植实验，对相应的4个共移植实验组及aGVHD对照组进行移植后一般情况观察，定期体重监测，外周血象及嵌合体测定，GVHD临床综合评分，组织病理学半定量评分，对各组GVHD状况进行综合评价，并选择移植后14天、28天、35天、60天及濒死前等不同的时间点，采集制备各组实验鼠血清，以ELISA法进行mIL—10、mIL—4、mINF—γ及mTNF—a定量检测。采用SPSS11．5 FOR WINDOWS统计软件分析数据，检验水准α=0．05。 结果：①收集经骨片冲洗的小鼠骨髓冲出液接种培养，经传代培养3代以上后细胞呈现为均质性较好的短梭形细胞，漩涡或放射状生长；优化选择Mesencult完全培养基为MSC/MPC培养体系；细胞可传代生长10代以上保持生物学特性稳定，选择P3代培养细胞为实验用细胞；对数生长期的群体倍增时间（Td）为31．1±0．6小时；细胞汇合80%—90%时G0/G1期细胞百分率80．3%，G2期细胞12．40/0，S期细胞7．3%；P3代细胞表面抗原高表达CD29、CD44、CD105、Sca—1，极低表达CD45，低到中度表达CD31；P3代细胞经体外定向诱导培养，可分化为成骨及脂肪细胞，证实所培养细胞具备多向分化潜能；RT—PCR法检测培养细胞mIL—10mRNA，双抗体夹心ELISA法检测细胞培养上清中mIL—10，均未能证实mMSC/MPC体外表达分泌mIL—10。②扩增产物经酶切鉴定、PCR扩增、DNA测序均证实为小鼠白介素10；构建制备的重组腺病毒Ad5—mIL—10经PCR鉴定正确，滴度达2．5×1010pfu/ml；Ad5—mIL—10以最宜MOI值200转染mMSC/MPC时能获得高效稳定的体外表达，符合体内实验要求。③雄性F1（CB6F1）小鼠为受鼠，经直线加速器6mvX射线一次性全身照射（总剂量12Gy，剂量率100cGy/min），接受雌性C57BL/6供鼠1×107骨髓MNC/3×107脾MNC（每只）联合输注时，可在相对集中的时间内（+24d～+28d）稳定地引出典型aGVHD，临床及病理程度较一致，死亡时间相对集中（+27d～+33d），以此为参数建立H—2单倍型骨髓移植aGVHD模型；体内共移植实验结果显示：以1×105/只MSC/MPC共移植时可降低aGVHD的发生及严重程度（P<0．05），提高细胞剂量（5×105/只）并不能增强实验效应（P>0．05）；同细胞剂量的mIL—10基因转染修饰MSC/MPC共移植能更为显著地减低aGVHD的发生及严重程度（P<0．01），但并不能降低甚至可能会加重cGVHD的发生及严重程度，提高细胞剂量其效应无显著差别（P>0．05）。细胞因子检测显示：MSC/MPC共移植在+14d明显上调受鼠体内IL—4水平（P<0．01），对IL—10影响不显著（P>0．05），同时明显减低INF—γ和TNF—a水平（P均<0．05）；mIL—10基因转染修饰的MSC/MPC共移植较MSC/MPC更高地上调了受鼠体内IL—10水平（P<0．01），同时协同上调IL—4水平（P<0．05），更显著地减少了INF—γ生成（P<0．01），但IL—10水平的上升可能也增加了受鼠发生及加重cGVHD的风险。 结论：⑴成功分离、培养了正常C57BU6小鼠的骨髓间充质干/祖细胞，生物学特性稳定，具有良好的增殖能力和向成骨、脂肪细胞的分化潜能，可用于进行基因转染修饰及应用于动物模型。⑵成功构建了重组AD5—mIL—10复制缺陷型腺病毒载体系统，并证实对mMSC/MPC具有较高的转染效率并获得高效稳定的体外表达。⑶成功建立了雌性C57BL/6小鼠→F1（CB6F1）雄性小鼠方向的H—2单倍型骨髓移植aGVHD模型。1×105／只MSC/MPC共移植可降低aGVHD的发生及严重程度，提高细胞剂量（5×105只）并不能增强效应。不同程度地上调受鼠IL—4水平（但对IL—10影响不显著），同时明显减低INF—γ和TNF—a水平，这可能是MSC/MPC移植减轻aGVHD的机制之一。1×105/只mIL—10基因转染修饰MSC/MPC共移植能更显著地减低aGVHD的发生及严重程度，但并不能降低甚至可能会加重cGVHD的发生及严重程度，提高细胞剂量其效应无显著差别；mIL—10基因转染修饰MSC/MPC较未修饰者更高地上调了受鼠IL—10水平，同时协同上调体内IL—4水平，更为显著地减少INF—γ生成，可能是最终显著降低aGVHD发生及严重程度的原因，但IL—10水平上调也增加了受鼠发生及加重cGVHD的风险。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词表

声明

第一部分小鼠骨髓间充质干／祖细胞体外培养体系的优化及相关生物学研究

材料与方法

结 果

讨 论

参考文献

第二部分mIL-10重组复制缺陷型腺病毒载体的构建、制备及转染mMSC／MPC表达

材料与方法

结 果

讨 论

参考文献

第三部分 mIL-10基因转染修饰骨髓间充质干／祖细胞在H-2单倍型骨髓移植aGVHD模型中的生物免疫学效应

材料与方法

结 果

一. 小鼠H-2单倍型骨髓移植aGVHD模型的建立

二.MSC／MPC及mIL-10基因转染修饰MSC／MPC共移植在小鼠H-2单倍型骨髓移植aGVHD模型中的生物免疫学效应：

讨 论

参考文献

全文总结

综述：间充质干细胞的免疫生物学及在造血干细胞移植中的应用

攻读博士学位期间撰写论文及参编专著情况

致谢