雷帕霉素诱导的CD4CD25T调节细胞对单倍型相合造血干细胞移植的影响及HLA-Cw位点在单倍型相合造血干细胞移植中的作用

摘要

[目的]： 建立CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞稳定的体外扩增体系，探讨CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞与单倍型相合造血干细胞移植GVHD的相关性以及对植入、GVHD、GVL、长期生存的影响；探讨HLA—Cw位点在单倍型相合造血干细胞移植中的作用，为优化供体的选择提供有价值的指标。 [方法]： 在论文的第一部分，采用磁珠分选BalB/C小鼠脾脏中的CD4+T细胞，2ug/mlaCD3单克隆抗体包板，在含有1ug/ml aCD28单克隆抗体、rhIL—2100U/ml和终浓度为10nM雷帕霉素RPMI—1640完全培养基中培养3周，流式细胞仪检测CD4+CD25+T细胞的表达，磁珠分选CD4+CD25+T细胞，实时定量PCR检测Foxp3mRNA的表达，单向混合淋巴细胞反应和增殖抑制试验，IL—10和TGF—β1的测定，与未加雷帕霉素对照组进行比较，探讨雷帕霉素在体外对CD4+CD25+Foxp3+T细胞扩增的影响。 论文的第二部分，按照成人给药剂量，给实验小鼠雷帕霉素灌胃3周后，流式细胞仪检测小鼠脾细胞中CD4+CD25+T细胞的含量，实时定量PCR检测脾细胞Foxp3 mRNA的表达，磁珠分选CD4+CD25+T细胞，进行体外抑制试验，ELISA检测小鼠血清中IL—10和TGF—β1的含量，与正常未给药组小鼠比较，了解雷帕霉素在小鼠体内对CD4+CD25+Foxp3+T细胞增殖的影响。 在第三部分中，通过小鼠GVHD移植模型，观察发生GVHD时小鼠体内CD4+CD25+T细胞以及脾细胞内Foxp3 mRNA表达的变化，与正常未移植和自体移植小鼠对比，明确GVHD与CD4+CD25+Foxp3+T细胞之间的相关性。 在论文的第四部分，通过尾静脉和腹腔注射两种途径，建立可移植性EL9611红白血病BalB/C和CB6F1小鼠模型，外周血涂片瑞氏—吉姆萨染色以及脏器的病理检查，了解接种EL9611红白血病小鼠脾细胞后，BalB/C和CB6F1小鼠发病规律。 在第五部分中，通过对发病的CB6F1小鼠进行骨髓移植，观察输注雷帕霉素体外培养扩增的CD4+CD25+Foxp3+T细胞小鼠植入、GVHD、以及白血病复发，与自体移植组和GVHD组小鼠对比，明确CD4+CD25+Foxp3+T细胞对GVHD、植入和GVL方面的影响。 在论文的最后部分中，采用高分辨的方法，对21例接受单倍型相合的造血干细胞移植的供受者的HLA—Cw位点进行检测，结合临床资料，分析供受者间HLA—Cw相容性对GVHD、白血病复发以及生存的影响。 [结果]： （一）在上述培养体系中，CD4+T细胞培养3周后，CD4+CD25+T细胞达（76.05±2.73）%，高于未加雷帕霉素组（52.17±1.36）%（P<0.001），Foxp3 mRNA的表达是对照组的5倍（P<0.001），增殖能力是对照组的0.29倍（P<0.001），对CD4+T细胞增殖抑制能力是对照组的3.6倍（P<0.001），培养上清中IL—10和TGF—β1分别是未加雷帕霉素组的1.8倍和1.6倍（P<0.001）。 （二）雷帕霉素灌胃小鼠脾细胞CD4+CD25+T细胞是对照组的2.8倍（P<0.001），Foxp3 mRNA的表达是对照组的6倍（P<0.001），磁珠分选CD4+CD25+T细胞对CD4+T细胞增殖的抑制率与对照组相比无差异（57.03% vs56.95%）（P>0.05）。雷帕霉素组和未给药组小鼠血清中IL—10的含量分别为（166.28±24.07）pg/ml和（79.50±7.68）pg/ml，TGF—β1的含量分别为（166.28±24.07）pg/ml和（88.52±10.06）pg/ml，各组间差异有显著性（P<0.001）。 （三）在发生GVHD的时间点时，自体移植组和GVHD组小鼠脾脏CD4+CD25+T细胞为15.4%，GVHD组小鼠脾脏CD4+CD25+T细胞为24.03%，而正常未移植小鼠脾脏CD4+CD25+T细胞为8.46%，各组间差异有显著性（P<0.001）；Foxp3 mRNA的表达在自体移植组和正常未移植组无差异（与HPRT标化后为0.1144 vs0.1294）（P>0.05），而GVHD组小鼠Foxp3 mRNA的表达经标化后仅为0.0331（P<0.001）。 （四）8～10周龄的BalB/C和CB6F1小鼠尾静脉注射1×106 EL9611红白血病小鼠脾细胞，外周血出现白血病细胞的时间分别为接种后的第6天和第7天，死亡时间分别为13.3天和21.7天。腹腔接种1×106 EL9611红白血病小鼠脾细胞，外周血出现白血病细胞的时间分别为接种后的第17.2天和第24.6天，死亡时间分别为21.7天和27.5天。 （五）Treg移植组小鼠GVHD的累积发生率为28.6%，GVHD对照组累计发生率为100%，经Log Rank检验，P=0.000，自体移植组白血病复发率为57.14%，Treg移植组未发现白血病复发。在移植后第10天、20天和30天，Treg移植组小鼠测得的嵌合度均高于GVHD组小鼠。 （六）在HLA—Cw位点相合组，Ⅱ～Ⅳ度aGVHD的累积发生率为77%，而在HLA—Cw位点不相合组，Ⅱ～Ⅳ度aGVHD的累积发生率只有14.3%，明显低于相合组，差异有显著性（P<0.01）；HLA—Cw不合组28个月累积生存率为85.7%，相合组28个月累积生存率为49%，差异无显著性（P>0.05），可能与病例数较少有关。 [结论]： （一）雷帕霉素在体内和体外都能促进CD4+CD25+Foxp3+T调节细胞的增殖，而且增殖的CD4+CD25+Foxp3+T调节细胞仍具有免疫调节作用。 （二）发生GVHD时，CD4+CD25+T细胞增高，而CD4+CD25+Foxp3+T调节细胞的数量是降低的。 （三）给CB6F1小鼠尾静脉注射1×106可移植性BalB/C小鼠EL9611红白血病脾细胞，可以建立稳定可靠的CB6F1小鼠白血病模型，但以尾静脉接种的EL9611红白血病小鼠适合于观察白血病小鼠的骨髓移植模型中GVL效应。 （四）CD4+CD25+Foxp3+T调节细胞不但能有效的减轻小鼠移植GVHD的发生，同时能促进植入，不削弱GVL效应。 （五）在单倍型相合的造血干细胞移植中，供受者间HLA—Cw位点的检测可以作为优化供体选择的指标之一。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：中英文缩略词汇表

声明

引 言

第一部分雷帕酶素对CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞体外扩增

前言

材料和方法

结 果

讨 论

参考文献

第二部分雷帕酶素对BalB/C小鼠T调节细胞体内作用的研究

前言

材料和方法

结 果

讨论

参考文献

第三部分CD4+CD25+Foxp3+T调节细胞与小鼠GVHD的相关性分析

前言

材料与方法

结 果

讨 论

参考文献

第四部分CB6F1小鼠EL9611红白血病模型的建立

前言

材料与方法

结 果

讨 论

参考文献

第五部分CD4+CD25+调节性T细胞对单倍型相合的小鼠骨髓移植的实验研究

前言

材料与方法

结 果

讨 论

参考文献

第六部分HLA-Cw位点在单倍型相合造血干细胞移植中的作用

前言

材料与方法

结 果

讨 论

参考文献

结 论

发表的文章及参加学术会议的论文

致 谢