供者自然杀伤细胞输注及IL-2、IL-15治疗在异基因及单倍型相合造血干细胞移植中作用的实验研究

摘要

一、小鼠脾NK细胞纯化、体外培养和鉴定 目的：探讨小鼠NK细胞分选方法、体外NK细胞培养扩增体系的建立及体外培养对NK细胞杀伤活性的影响。 方法：采用流式细胞术检测小鼠脾脏淋巴细胞亚群百分比。采用抗Thy-1．2抗体标记免疫磁珠去除T细胞及抗DX5抗体标记免疫磁珠正选NK细胞。流式细胞仪检测分选NK细胞纯度。采用含IL-2或(和)IL-15的体外培养体系，比较不同培养体系培养扩增效率。采用LDH释放法检测NK细胞杀伤活性。 结果：B6成年小鼠脾脏CD3-DX5+NK细胞占3．0．5．5％。经磁珠两步法分选后CD3-DX5+NK细胞纯度高于95％。含10ng/mL rhIL-2和100ng/mL rhIL-15的DMEM完全培养基培养分选的脾NK细胞第3天、6天、9天、12天、15天时细胞计数倍数为1．27±0．05、3．14±0．18、6．23±0．28、10．81±0．92、23．10±1．44。NK细胞培养后免疫表型为CD3-DX5+，CD3-DX5+NK细胞占95．0％以上。静息NK细胞杀伤活性弱。效：靶比为10:1时NK细胞毒性为28．7％，而培养激活后效：靶比为10:1时NK细胞毒性为96．3％。 结论：采用抗Thy-1．2和DX5免疫磁珠可高纯度分选小鼠NK细胞，体外含IL-2和IL-15的DMEM完全培养基可有效扩增NK细胞，联合应用可提高培养扩增效率，体外培养扩增的NK细胞免疫表型仍为CD3-DX5+，扩增后NK细胞杀伤活性比静息NK细胞杀伤活性高。 二、建立小鼠异基因造血干细胞移植aGVHD和白血病模型 目的：建立B6→BALB/c小鼠异基因造血细胞移植后非致死性aGVHD模型和EL9611白血病异基因造血细胞移植模型。 方法：32只SPF级BALB/c小鼠随机分为4组，各组小鼠分别接受6、7、8、9Gy X射线全身照射。C57BL/6(H-2b，♂)小鼠为供鼠，BALB/c小鼠(H-2d，♀)为受鼠。32只BALB/c小鼠经预处理后随机分为4组，分别尾静脉输注1×106、2．5×106、5×106、10×106个骨髓细胞重建造血。在能重建造血的基础上建立aGVHD模型，输注BMCs基础上输注5×106、10×106或20×106个脾细胞。6-7周龄SPF级BALB/C小鼠尾静脉接种1×106个EL9611细胞。接种8天后分组：无TBI对照、TBI对照、同基因BMT对照、异基因BMT组，每组8只。 结果：接受6Gy剂量的小鼠全部生存。接受7Gy TBI预处理的小鼠中位生存期为28．0天，33天内全部死亡。8Gy TBI预处理的小鼠中位生存期为12．7天，15天内全部死亡。四组生存时间采用Log-rank检验，χ2=47．24，P<0．0001。输注2．5×106骨髓细胞不能全部重建造血，100天生存率分别为62．5％，其余死于内脏出血。输注5×106骨髓细胞可全部重建造血，100天生存率为100％。单纯输注骨髓细胞不能诱发aGVHD。低剂量脾细胞输注小鼠aGVHD疾病程度轻未出现aGVHD相关死亡，中剂量脾细胞输注小鼠25％出现aGVHD相关死亡，高剂量脾细胞输注小鼠41天内100％死于aGVHD。单纯TBI处理组小鼠处理后14天内全部死于造血衰竭。同基因对照小鼠20天内全部死于白血病。异基因BMT组1/8只小鼠长期生存，7/8只小鼠于BMT后45天内死于白血病复发。四组生存时间采用Log-rank检验，χ2=40．22，P<0．0001。+28d外周血细胞及脾细胞均达到完全供者嵌合体状态。 结论： TBI8Gy对于BALB/c小鼠是清髓性预处理。预处理后输注输注5×106个骨髓细胞可全部重建造血。输注5×106个脾细胞可诱发轻至中度aGVHD，不出现致死性aGVHD。移植前8天尾静脉接种1×106个EL9611白血病细胞可成功建立白血病微小残留病模型。 三、供者NK细胞输注及IL-2、IL-15治疗对异基因造血干细胞移植后GVHD、白血病复发和免疫重建的影响 目的：探讨体外培养扩增的供者NK细胞输注及IL-2、IL-15治疗对异基因造血干细胞移植后GVHD、白血病复发和淋系免疫重建的影响。 方法：采用临床GVHD积分方法评价小鼠GVHD严重程度；定量PCR方法检测脾细胞sjTREC评价胸腺输出功能；RT-PCR方法检测T细胞受体β链谱型；流式细胞仪检测淋系重建；外周血涂片瑞氏染色检测白血病复发。在GVHD模型中40只小鼠随机分为4组。BMT对照组：输注B6小鼠来源BMCs5×106个；GVHD对照组：输注B6小鼠来源BMCs5×106个+SCs5×106个；NK细胞输注组：输注B6小鼠来源BMCs5×106个+SCs5×106个+NK1×107个；NK细胞输注及IL2、IL-15治疗组：输注B6小鼠来源BMCs5×106个+SCs5×106个+NK1×107个，移植后每天腹腔注射IL-2、IL-15共7天。在EL9611白血病模型中BALB/c小鼠移植前-8d尾静脉接种1×106个EL9611细胞，70只小鼠分为6组，每组9-12只。TBI对照组：单纯TBI处理；同基因造血细胞移植对照组：输注BALB/c小鼠来源BMCs5×106个+SCs5×106个；异基因造血细胞移植对照组：输注B6小鼠来源BMCs5×106个+SCs5×106个；NK细胞输注组：输注B6小鼠来源BMCs5×106个+SCs5×106个+NK1×107个；NK细胞输注及IL2、IL-15治疗组一：输注B6小鼠来源BMCs5×106个+SCs5×106个+NK1×107个，移植后每天腹腔注射IL-2、IL-15共7天；NK细胞输注及IL2、IL-15治疗组二：输注B6小鼠来源BMCs5×106个+SCs5×106个+NK1×107个，移植后每天腹腔注射IL-2、IL-15共14天。 结果：骨髓移植对照组BALB/c小鼠不出现GVHD表现。GVHD对照组小鼠移植后7天时出现不同程度的GVHD表现，并出现GVHD相关体重减轻。NK细胞输注组小鼠也出现aGVHD表现，但临床GVHD评分比对照组评分低。NK细胞输注及IL2、IL-15治疗组小鼠各观察时间点临床GVHD评分比对照组评分明显低。单纯异基因骨髓移植组小鼠的皮肤、肝脏和肠道未见明显的病理改变。 结论：体外培养扩增的供者NK细胞输注及IL-2、IL-15治疗可减轻异基因造血干细胞移植后GVHD严重程度，保护胸腺增强输出功能促进T细胞谱型重建，促进外周T细胞、B细胞、NK细胞等淋系重建，增强移植物抗白血病作用减少白血病复发。 四、供者NK细胞输注及IL-2、IL-15治疗对单倍型相合造血干细胞移植后GVHD、白血病复发和免疫重建的影响 目的：建立B6→CB6F1单倍型相合造血细胞移植后非致死性aGVHD模型，探讨体外培养扩增的供者NK细胞输注及IL-2、IL-15治疗对单倍型相合造血细胞移植后GVHD、白血病复发和免疫重建的影响。 方法：采用临床GVHD积分和病理组织学方法评价小鼠GVHD严重程度；实时定量PCR方法检测sjTREC拷贝数评价移植后胸腺输出功能；RT-PCR结合毛细管电泳检测T细胞受体β链谱型评价TRBV谱型；多参数流式细胞仪检测脾脏淋系重建；外周血涂片瑞氏染色检测白血病复发。在GVHD模型中40只小鼠随机分为4组，每组10只。骨髓移植对照组：输注B6小鼠来源BMCs5×106个；GVHD对照组：输注B6小鼠来源BMCs5×106个+SCs15×106个；NK细胞输注组：输注B6小鼠来源BMCs5×106个+SCs15×106个+NK1×107个；NK细胞输注及IL2、IL-15治疗组：输注B6小鼠来源BMCs5×106个+SCs15×106个+NK1×107个，移植后每天腹腔注射IL-2、IL-15共7天。在EL9611白血病模型中CB6F1小鼠移植时尾静脉接种2×106个EL9611白血病细胞，每组10只。单倍型相合造血细胞移植对照组：输注B6小鼠来源BMCs5×106个+SCs10×106个；NK细胞输注组：输注B6小鼠来源BMCs5×106个+SCs10×106个+NK1×107个：NK细胞输注及IL2、IL-15治疗组一：输注B6小鼠来源BMCs5×106个+SCs10×106个+NK1×107个，移植后每天腹腔注射IL-2、IL-15共7天；NK细胞输注及IL2、IL-15治疗组二：输注B6小鼠来源BMCs5×106个+SCs10×106个+NK1×107个，移植后每天腹腔注射IL-2、IL-15共14天。 结果：11．5Gy X线TBI对于CB6F1小鼠为清髓性预处理。GVHD对照组小鼠移植后7天时出现GVHD表现。NK细胞输注组小鼠各时间点临床GVHD评分比对照组评分低。NK细胞输注及IL2、IL-15治疗组小鼠各观察时间点临床GVHD评分比对照组评分明显低。GVHD对照组小鼠出现皮肤、肝脏和肠道可见明显的病理改变。NK细胞输注组小鼠GVHD靶器官病理改变较GVHD对照组轻。 结论：体外培养扩增的供者NK细胞输注及IL-2、IL-15治疗可减轻单倍型相合造血干细胞移植后aGVHD严重程度，保护胸腺增强输出功能促进T细胞谱型重建，促进外周T细胞、B细胞、NK细胞等淋系重建，增强移植物抗白血病作用减少白血病复发。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：中英文缩略词汇表

声明

引 言

第一部分小鼠脾NK细胞纯化、体外培养和鉴定

前 言

材料和方法

结 果

讨论

参考文献

第二部分建立小鼠异基因造血干细胞移植aGVHD和白血病模型

前言

材料和方法

结 果

讨论

参考文献

第三部分供者NK细胞输注及IL-2、IL-15治疗对异基因造血干细胞移植后GVHD、白血病复发和免疫重建的影响

前 言

材料与方法

结 果

讨论

参考文献

第四部分供者NK细胞输注及IL-2、IL-15治疗对单倍型相合造血干细胞移植后GVHD、白血病复发和免疫重建的影响

前 言

材料与方法

结 果

讨论

参考文献

结论

综述1：IL-2和IL-15生物学及应用研究进展

综述2：自然杀伤细胞免疫治疗研究进展

攻读学位期间公开发表的论文

致谢