重组鼠IL-12腺病毒转染库普弗细胞对脾T淋巴细胞免疫功能调节的体外实验研究

摘要

目的：(1)分离纯化并鉴定SD大鼠库普弗细胞(Kupffer Cell，KC)，得到较高纯度及活力的KC。(2)重组腺病毒Adv-IL-12体外转染KC，检测IL-12)及MHC-Ⅰ类分子(H2-K<'b>)、MHC-Ⅱ类分子(Ⅰ-A<'b>)的表达情况。(3)观察Adv-IL-12转染的KC对脾T细胞免疫功能的影响，为靶向治疗肿瘤肝内微转移的实验研究提供依据。 方法：(1)采用Ⅳ型胶原酶、链霉蛋白酶E(PronaseE)灌注消化，Nycodenz密度梯度离心法得到SD大鼠肝脏非实质细胞(nonparenchymal cells，NPC)，再以选择性贴壁法纯化KC。以台盼蓝拒染实验判断细胞产率和存活率；以细胞自发荧光现象、吞噬实验及ED-2单克隆抗体染色法对KC进行鉴定。 (2)24孔细胞培养板中培养KC，细胞密度为1×10<'6>/ml，共设置3组，分别为KC细胞对照组(下称细胞对照组)、KC+Adv-EGFP病毒对照组(下称病毒对照组)和KC+Adv-IL-12试验组(下称实验组)，每组设三个复孔。分别于转染后24h、48h收取3组细胞上清，以ELISA试剂盒检测细胞上清中IL-12的表达量；转染后48h收集各组细胞，以半定量RT-PCR法检测MHC Ⅰ类分子(H-2K<'b>)及MHC Ⅱ类分子(Ⅰ-A<'b>)mRNA对应于内参照三磷酸甘油醛(GAPDH)的相对含量。(3)常规制备大鼠脾淋巴细胞(Splaniclymphocyte，SLC)，调整密度为2×10<'6>/ml，加入ConA(终浓度5μg/ml)刺激培养72小时后，与事先以重组IL-12腺病毒转染的KC混合培养，SLC与KC之比为10：1，分4组：SLC+Adv-IL-12-KC组(A组)、SLC+Adv-EGFP-KC组(B组)、SLC+KCN(C组)、单独SLC组(DN)，每组设三个复孔。共同培养72h后，收集各孔培养上清及SLC，ELISA法测定培养上清中IFN-γ和IL-4蛋白的水平；以荧光标记的抗大鼠CD4、CD8单抗染色，流式细胞仪测定各组SLC中CD4T、CD8T细胞亚群变化。 结果：(1)实验中每只SD大鼠可得N3.5-5.0×10<'7>个KC，细胞的存活率可达到93％以上；ED-2单抗染色鉴定，KC纯度达95％以上。(2)50 MOI剂量的重组腺病毒感染KC，ELISA检测：转染后24h，实验组上清IL-12浓度即明显升高，达对照组的10倍左右，48h测定IL-12浓度继续升高，实验组IL-12浓度可达1000pg/ml以上水平，与对照组比较差别具有显著统计学意义；而细胞对照组和病毒对照组KC也有一定的基础分泌，前者IL-12分泌量略低于后者，但差别不具有统计学意义。半定量RT-PCR法检测表明实验组H-2K<'b>/GAPDH和Ⅰ-A<'b>/GAPDH比值分别为0.835，0.739，分别上调了1.5倍(H-2K<'b>)和2.0倍(Ⅰ-A<'b>)，与病毒对照组和细胞对照组比较差异有统计学意义，而病毒对照组和细胞对照组比较差异无统计学意义。(3)ELISA检测可见：A组、B组、C组和D组培养上清中IFN-γ含量依次为2026.29±103.37、988.55±94.39、1005.36±120.18、505.12±55.28(pg/mL)，而IL-4含量依次为206.94±22.43、349.84±49.61、320.57±34.73、828.2±62.83(pg/mL)。FCM检测显示：A组SLC中CD4T细胞比例、T细胞总数(CD4T细胞和CD8T细胞之和)及CD4T/CD8T比值均显著增大，与其他3组相比有显著差异，但CD8T细胞比例在各组间无明显差异；B组与C组、D组之间在各项指标上的差异不具有统计学意义；C组的CD4T细胞比例及T细胞总数高于D组，但两组CD8T细胞比例及CD4T/CD8T比值之间无明显差别。 结论：(1)采用Ⅳ型胶原酶、PronaseE灌注消化，Nycodenz密度梯度离心及选择性贴壁法能够分离出较高纯度和活力的KC，能满足进一步的实验要求。(2)在体外腺病毒载体能有效的转染KC；IL-12基因修饰后，KC能高表达IL-12蛋白；其MHC Ⅰ和MHC Ⅱ分子基因转录增强，说明IL-12基因修饰能够上调KC的抗原提呈能力。(3)IL-12基因修饰的KC细胞与脾淋巴细胞混合培养，能显著增加混合淋巴细胞中CD4T细胞的比例，而对CD8T细胞无明显影响，结果导致CD4T/CD8T比值增大；由IL-12诱导的CD4T细胞增殖主要分化为Th1细胞，培养上清中Th1型细胞因子IFN-γ的含量显著增加反映了这一变化，与此同时Th2方向的分化受到抑制，并表现为Th2型细胞因子IL-4分泌量的显著减少。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：主要英文缩略词汇表

声明

研究背景

第一部分SD大鼠肝脏Kupffer细胞的分离培养与鉴定

第二部分重组鼠IL-12腺病毒体外转染Kupffer细胞的实验研究

第三部分IL-12基因修饰的Kupffer细胞对脾淋巴细胞免疫功能影响的实验研究

参考文献

结论

综述 Kupffer细胞对肝脏转移癌的预防作用

学习期间发表的论文

致谢