大鼠电针镇痛及束缚应激后恢复速度个体差异的基因解析

摘要

目的：⑴利用基因芯片技术筛查大鼠下丘脑与电针镇痛相关的候选基因，以期寻找电针镇痛中出现个体差异的分子基础。⑵利用基因芯片技术筛选大鼠下丘脑中可能参与束缚应激后恢复过程的差异基因，探讨不同个体对应激反应的差异性。 方法：①脉冲电流连接电针以1赫兹（Hz）频率刺激大鼠足三里穴位1小时。采用辐射热甩尾法（Tail—Flick Test）测定大鼠甩尾潜伏期（TFL），以此作为痛阈指标。根据电针效果（痛阈提高率Pain Threshold Increase Rate，PTIR）将大鼠分为有电针镇痛效果（responder，PTIR大于30%）和无镇痛效果组（non—responder，PTIR小于25%）。利用基因芯片技术分析有电针镇痛效果与无电针镇痛效果大鼠的下丘脑基因表达差异。芯片杂交设计采用等半交换（Half dye—swap）方法，一半有电针镇痛效果与一半无电针镇痛杂交的荧光组合为Cy3比Cy5，另一半为Cy5比Cy3。芯片扫描结果经Signifcance Analysis of Microarrays（SAM）软件包分析筛选两组间表达存在差异的基因。利用GeneTools在线软件，根据基因的生物学功能将差异表达基因进行功能分类。最后利用实时定量逆转录PCR（real—time quantitative RT—PCR）方法验证部分差异表达基因。②在大鼠束缚应激模型上，采用酶联免疫方法（ELISA）和放射免疫方法（RIA）测定应激开始前、应激结束时、恢复1小时后血浆皮质酮及ACTH水平。依据两种激素在应激2小时结束时的水平将试验组分为高反应组与低反应组。在高反应组中，根据应激结束至恢复1小时后血浆皮质酮及ACTH的下降程度分为快速恢复组与慢速恢复组。利用基因芯片技术分析快速恢复组与慢速恢复组大鼠下丘脑的基因表达差异。杂交设计采用了等半交换（half dye swap）的方法，即一半的高反应组对低反应组为Cy3比Cy5，另一半为Cy5比Cy3。根据芯片设计方案，我们采用了一种特殊的均一化（normalization）及固定效应方差分析（fixed effect ANOVA）模型对芯片数据进行了差异表达分析。最后采用实时定量逆转录PCR（real—time quantitative RT—PCR）对芯片分析的部分结果进行验证。 结果：⑴实验结果再次证实电针镇痛中存在着个体差异，约有30%的个体在电针后没有镇痛效果。PTIR在对照组平均升高7%，而在电针组平均升高了26%。⑵在筛选出的两组间存在差异表达的66个基因中，有63个上调，有3个下调，上下调倍数最少为1．54倍。⑶约半数（34个）差异表达基因可归入9个功能组，分别是离子转运、感知觉、突触发生与传递、信号转导、炎症反应、凋亡、转录、蛋白氨基酸磷酸化和G蛋白信号传导。⑷钾离子电压门控通道调控的超家族成员H—7基因、γ—氨基丁酸A型受体、参与钠钙离子交换的Solute carrier family8，member3、突触囊泡糖蛋白2b、神经生长素1、黑皮质素4型受体和胃促进素前体共7个基因的RT—PCR验证结果与芯片分析结果基本一致。⑸束缚应激后血浆皮质酮及ACTH水平在不同个体间存在较大差异，即有的个体对束缚应激反应较强（应激结束时血浆皮质酮及ACTH浓度分别为27．41±3．23 ug/dl及499．69±33．73 pg/ml），有的个体较弱（应激结束时血浆皮质酮及ACTH浓度分别为12．01±1．91 ug/dl及434．21±31．28 pg/ml）。快速恢复组与慢速恢复组比较发现，应激结束后1小时血浆皮质酮及ACTH水平在两组间存在显著性差异。⑹芯片分析结果显示快速恢复组与慢速恢复组间大多数基因并无差异表达。有差异表达的8个基因中，与整合素信号通路（integrin signaling pathway）相关的基因如踝蛋白（Talin）、丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酯酶PP—β催化亚单位（Serine/threonineprotein phosphatase PP1—beta catalytic subunit）、整合素α—6前体（Integrin alpha—6precursor）和肌球蛋白IXb（Myosin IXb）在快速恢复组均上调1．5倍以上，而接合粘附分子1号（junctional adhesion molecule1）有1．5倍下调。⑺踝蛋白、整合素α—6前体等基因的Real—time RT—PCR验证结果与芯片分析结果基本一致。 结论：①电针镇痛中存在个体差异，这种个体差异可能与下丘脑的离子转运功能的相关基因、谷氨酸受体和神经生长素1基因的表达差异有关。这些基因有望成为痛觉研究的新靶点，值得进一步深入研究。另外，我们的实验结果提示：黑皮质素4型受体（Melanocortin4 receptor，MC4R）基因、胃促进素前体（Ghrelin precursor）基因和激素敏感性脂肪酶（Lipase，hormone sensitive）基因有可能是电针疗法治疗肥胖的内在分子靶点，这一发现将有助于阐明电针减肥的具体分子机制。②相同的应激原（stressor）在不同个体可引起不同的应激反应，应激反应的恢复在不同的个体亦不相同，这种个体差异是否与下丘脑的整合素信号通路相关基因有关，本实验目前尚不能确定，有待于进一步研究。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一部分大鼠电针镇痛中个体差异的基因解析

引言

材料与方法

结果

讨论

参考文献

第二部分束缚应激大鼠恢复速度个体差异的基因解析

引言

材料与方法

结果

讨论

参考文献

论文总结

文献综述：电针镇痛的分子机制

附录1 RNAeasy Mini Kit提取下丘脑组织总RNA流程

附录2 cRNA合成、纯化及片断化操作步骤

附录3 皮质酮ELISA检测步骤

附录4 ACTH RIA检测步骤

附录5 论文第一部分芯片Feature Extraction Software分析结果

附录6 论文第二部分芯片Feature Extraction Software分析结果

攻读博士学位期间发表论文一览表

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