环介导等温扩增检测孕妇血清中巨细胞病毒方法的建立及初步应用

摘要

人类巨细胞病毒(Human Cytomegalovirus，HCMV)是引起孕妇活动性感染及胎儿宫内感染最常见、也是危害最大的病毒之一。它可在感染孕妇后经胎盘或上行性感染传播给胎儿，导致流产、死胎、畸形及出生后多器官功能障碍等严重后果。传统ELISA法的敏感性和特异性均不能满足临床要求，而荧光定量PCR(FQ-PCR)技术也存在着对技术设备要求高，检测成本昂贵等缺点。本研究目的在于建立一种灵敏度高、特异性强的低成本检测孕妇血清中HCMV DNA的方法并初步评价该技术在临床应用价值。 我们采用环介导等温扩增(100p-mediated isothermal amplification，LAMP)技术建立了快速检测孕妇血清中的HCMV DNA的反应体系。该方法在HCMV的IE1基因区段设计了二对特异性引物，在Bst DNA聚合酶作用下60℃恒温反应60分钟即可完成对HCMV DNA扩增过程。扩增产物以2.5％琼脂糖凝胶电泳检测。 为确立了最佳反应条件我们对LAMP反应体系进行了优化。实验表明温度是LAMP的最大影响因素，而镁离子和甜菜碱浓度对反应影响不大。为评价该技术的特异性，我们使用设计的特异HCMV引物同时对HCMV、单纯疱疹病毒1型、单纯疱疹病毒2型及人类基因组DNA进行LAMP扩增。仅HCMV DNA扩增产物在电泳后出现特异的梯状条带，进一步对该扩增产物的酶切结果也与预期相符。这表明LAMP技术对孕妇血清中HCMV DNA的扩增是特异的。我们对原始模板进行梯度稀释来测试其敏感性，实验结果表明LAMP技术可以稳定检出HCMVDNA的下限为102拷贝/ml。 应用LAMP方法对126例孕妇血清进行HCMV DNA检测并将结果与ELISA和FQ-PCR法相比较。结果显示在126例样本中，LAMP法、ELISA和FQ-PCR三种方法分别检出的42例、14例及44例。ELISA法与FQ-PCR阳性符合率31.8％，两种方法存在显著性差异(P<0 01)；LAMP法与FQ-PCR阳性符合率95.4％，差异不显著(P>0.01)。 因此我们的实验表明LAMP技术用于孕妇血清中HCMV DNA检测具有与FQ-PCR相近的特异性和敏感性，可靠性远高于目前普及的ELISA法。并且LAMP所具有操作简单快速，结果易判断和不需要复杂技术及设备的低成本优势也是FQ-PCR所不能及的。如果进一步优化、完善和推广，我们相信该技术将会在孕妇HCMv感染的早期诊断和出生缺陷及传染病的预防上发挥重要作用。

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文摘

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论文说明：缩略词表

声明

前言

文献综述

1巨细胞病毒

1.1巨细胞病毒概述

1.2巨细胞病毒的流行状况及致病性

1.3先天性巨细胞病毒的感染的诊断及其检测方法研究进展

2环介异等温扩增法

2.1环介导等温扩增法起源及特点

2.2环介导等温扩增法的原理

2.3环介导等温扩增法引物组成及设计原则

2.4环介导等温扩增法产物检测方法

2.5 LAMP的技术及进展应用

实验一环介导等温扩增检测孕妇血清中HCMV DNA方法的建立

1.材料

2.实验方法

3.结果

4.讨论

实验二环介导等温扩增检测孕妇血清中HCMV DNA方法初步应用

1.材料

2.实验方法

3.结果

4.讨论

结论

参考文献

学习期间发表的论文

致谢