RNAi沉默4-1BB基因表达抗大鼠肝移植急性排斥反应的实验研究

摘要

目的： （1）构建针对大鼠T淋巴细胞4—1BB基因编码区的小发夹RNA（shRNA）表达质粒和慢病毒载体系统，观察RNA（RNAi）对大鼠T淋巴细胞共刺激分子4—1BB基因表达和功能的影响。 （2）探讨阻断T淋巴细胞4—1BB/4—1BBL共刺激通路在大鼠肝移植急性排斥反应中的作用。 方法： （1）根据RNAi作用原理，设计、合成4条T淋巴细胞4—1BB基因的shRNA（shRNA441、shRNA540、 shRNA621、shRNA758），插入质粒pGPU6，构建4个编码目的shRNA的表达质粒（p441、p540、p621、p758），酶切及测序鉴定。设对照组，利用电穿孔法在体外将目的基因片段导入BN大鼠T淋巴细胞，48小时后，半定量逆转录·聚合酶链反应（RT—PCR）和流式细胞术（FCM）检测其对T细胞4—1BB基因表达的抑制作用，并筛选、确定最佳效果的干扰质粒。 （2）利用筛选出的质粒，PCR扩增其中的U6+shRNA序列，克隆至慢病毒转移质粒pcDNA—CMV—Lentivector并经酶切和测序鉴定，与包装质粒以脂质体介导共转染293T细胞，产生shRNA重组慢病毒。病毒颗粒感染BN大鼠T淋巴细胞6～8h后，与经丝裂霉素处理的Lewis大鼠淋巴细胞作单项混合淋巴细胞反应，设对照组和干扰组。RT—PCR、FCM、Western bloting方法检测4—1BB表达，MTT、3H—TdR检测干扰后T细胞的增殖能力，FCM测定凋亡细胞数，ELISA法检测细胞因子IL—2、IL—10、IFN—γ水平。 （3）“二袖套法”行Lewis鼠到Brown Norway（BN）鼠原位肝移植24例，大鼠随机分成实验对照组、阴性对照组和干涉实验组，每组8对。三组的受体鼠分别在移植前12 h经阴茎背静脉注射1ml生理盐水、空病毒和重组病毒液。于术后第5天每组处死BN鼠3只，取脾脏，RT—PCR、FCM检测在体T细胞4—1BB表达；取下腔静脉血检测细胞因子和生化指标；取肝组织观察病理变化；剩余大鼠观察术后生存情况。 结果： （1）经酶切反应及测序证实构建成功重组干扰质粒p441、p540、p621和p758，转染T细胞后，4—1BB相对表达量分别为（33.4±2.3）%、（53.0±2.3）%、（62.1±3.1）%、（40.9±1.5）%，对照组4—1BB相对表达量为（67.2±1.5）%。其中p441沉默效果最佳（p<0.01）。 （2）经酶切反应及测序证实，重组慢病毒转移质粒pLVs441序列正确，包装产生病毒液（LVs441）滴度在5×106TU/ml，浓缩后约3×108TU/ml。LVs441感染T细胞效率约90%，干涉组4—1BB表达量显著下降（p<0.01）；T细胞凋亡较明显（p<0.05）；T细胞增殖能力、IL—2，IFN—γ水平低于实验对照组。 （3）干涉组BN鼠脾淋巴细胞4—1BB表达量低于对照组（p<0.05）；两组IL—10、T—BIL水平无明显差别，但干涉组IL—2、IFN—γ和ALT、 AST、LDH水平均低于对照组（p<0.05）；对照组和干涉组大鼠肝组织急性排斥Banff评分分别为7.11±0.78、5.89±1.05（p=0.0384）、平均生存时间分别为10.4±1.95天和29±14.78天（p<0.05）。 结论： （1）siRNA可特异性抑制大鼠T淋巴细胞共刺激分子4—1BB基因转录和表达，诱发T细胞凋亡，抑制大鼠T细胞的增殖能力，降低IL—2，IFN—γ等细胞因子的分泌水平。 （2）RNAi阻断T细胞4—1BB/4—1BBL共刺激通路，可抑制肝移植大鼠急性排斥反应，延长受体存活时间。 （3）电穿孔技术是质粒载体转染原代T淋巴细胞的一种有效方法。 （4）慢病毒载体系统是携带siRNA进入T细胞的理想载体。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词表

声明

序言

第一部分大鼠4-1BB shRNA表达质粒的构建、鉴定和筛选

一、实验材料

二、研究方法

三、实验结果

四、讨论

五、结论

六、参考文献

第二部分大鼠4-1BB shRNA慢病毒表达载体的构建和鉴定

一、实验材料

二、研究方法

三、实验结果

四、讨论

五、结论

六、参考文献

第三部分大鼠原位肝移植模型的建立

一、实验材料

二、实验方法

三、实验结果

四、讨论

五、结论

六、参考文献

第四部分shRNA阻断4-1BB共刺激通路抑制大鼠肝移植急性排斥反应

一、实验材料

二、实验方法

三、实验结果

四、讨论

五、结论

六、参考文献

综述：肝脏移植免疫进展

攻读学位期间公开发表的论文

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