家蚕丝腺生物反应器表达hIGF-I转基因分泌表达载体的构建及其应用研究

摘要

家蚕(Bormbyx mori)，又名桑蚕，属鳞翅目家蚕蛾科。其幼虫丝腺具有强大的合成和分泌蛋白质的能力，利用家蚕丝腺生物反应器安全、高效地生产药用蛋白有很好的实用前景。近几年以转基因家蚕表达外源蛋白的技术体系正被逐步建立。人胰岛样生长因子(hIGF-I)具有多种生物学功能，本研究期望通过家蚕转基因实现hIGF-I在丝腺中分泌表达，开辟hIGF-I表达新途径，提高家蚕的利用价值。 我们克隆了丝素蛋白重链基因(fibroin heavy chain，fib-H)启动子及其下游信号肽序列即fib-HS；构建了fib-HS控制红色荧光蛋白(DsRed)报告基因的瞬时分泌表达载体pSK-FibHS-DsRed-PolyA；转染细胞实验显示，该载体能在家蚕BmN细胞中瞬时表达DsRed；家蚕注射该载体后，可在丝腺腔中检测到红色荧光，表明瞬时表达的DsRed分泌到丝腺腔，推测所克隆的序列具有信号肽的功能。 以fib-HS控制hIGF-I、家蚕杆状病毒ie-1启动子驱动新霉素抗性基因(ned)构建了基于piggyBac转座子的转基因分泌表达载体pigA3GFP-FibHS-IGF-PolyA-IE-Neo，在辅助质粒的存在下，pigA3GFP-FibHS-IGF-PolyA-IE-Neo转染家蚕BmN细胞，通过G418(终浓度800μg/mL)的压力筛选，获得了稳定表达MGF-I的转化细胞系，ELISA检测结果显示，hIGF-I在转化细胞中的表达水平约为29.5ng/l05cells。 采用精子介导法及基因枪法将pigA3GFP-FibHS-IGF-PolyA-IE-Neo转基因分泌表达载体导入家蚕，通过G418和荧光报告基因(GFP)的双重筛选，在G0代获得3头具有明显绿色荧光的家蚕；用gfp基因的特异性引物可从呈绿色荧光的家蚕基因组中特异性地扩增出gfp基因，表明所获得的荧光蚕为转基因家蚕；反向PCR分析插入位点结果显示，未发现piggyBac转座子特异性插入位点：ELISA检测结果显示，在G0代转基因家蚕的蚕茧中hIGF-I的表达量约756ng/g

目录

文摘

英文文摘

论文说明：中英文缩略表

声明

第一章 家蚕生物反应器的相关研究进展

1转基因动物研究概况

2动物生物反应器研究进展

3转基因昆虫的研究概况

4转基因家蚕研究概况

4.1转基因家蚕研究

4.2家蚕生物反应器研究概况

参考文献

第二章 胰岛素样生长因子的研究进展

1胰岛素样生长因子的分子结构和作用机理

1.1分子结构

1.2作用机理

2生物学功能

2.1 IGFs促生长发育的作用

2.2 IGFs的物质代谢作用

2.3 IGFs的免疫调节作用

3 IGF-I在动物生产中的研究应用

4研究展望

参考文献

第三章研究目的与内容

1研究的目的和意义

2研究技术路线

3研究内容

第四章材料与方法

1一般材料

1.1载体、菌种、细胞和家蚕

1.2工具酶及其试剂

1.3培养基

1.4缓冲液和常用溶液

2常用仪器

3常用实验方法

3.1 PCR扩增目的片段

3.2目的片段的分离和回收

3.3 DNA的酶切反应体系

3.4 DNA的连接反应体系

3.5质粒DNA的制备

3.6感受态细胞的制备

3.7连接产物的转化

3.8重组质粒的筛选

3.9限制性内切酶反应

3.10细胞的传代

第五章 家蚕丝素重链启动子驱动DsRed的瞬时分泌表达

1材料与方法

1.1材料

1.2方法

2结果与分析

2.1 pSK-FibHS-DsRed-PolyA的构建与鉴定

2.2带有信号肽序列的fib-H启动子在BmN细胞中的活性检测

2.3带有信号肽序列的Fib-H启动子在丝腺组织中的活性检测

4讨论

参考文献

第六章pigA3-GFP-Neo-En-[FibHS-IGF-polyA]转基因分泌表达载体的构建

1材料与方法

1.1材料与试剂

1.2方法

2结果与分析

2.1转基因分泌表达载体的酶切鉴定

3讨论

参考文献

第七章 piggyBac转座子介导的家蚕细胞转基因研究

1引言

2材料与方法

2.1实验材料

2.2方法

3结果与分析

3.1转化细胞的筛选

3.2转化细胞的PCR鉴定

3.3转化细胞的SDS-PAGE分析

3.4 ELISA检测转化细胞的hIGF-I的表达

4讨论

参考文献

第八章 pigA3-GFP-Neo-En-[FibHS-IGF-polyA]家蚕转基因研究

1引言

2材料与方法

2.1实验材料

2.2实验方法

3结果与分析

3.1 G0转基因家蚕的获得

3.2转基因家蚕的继代

3.3转基因家蚕的分子检测

3.4转基因家蚕蚕茧中目的蛋白IGF-I的表达分析

4讨论

参考文献

结论

硕士期间科研情况

致谢