药物(PZQ)压力下日本血吸虫的耐药性诱导及抗血吸虫新药的筛选

摘要

目的：
　　 1日本血吸虫吡喹酮耐药虫体的筛选及其超微结构的观察
　　 2体外实验观察地西泮类衍生物(B3，B30，B3-O2，B3-2O2)和五羟色胺/多巴胺受体拮抗剂（利培酮，奥氮平，喹硫平）的抗血吸虫效应。
　　 方法：
　　 (1)动物模型建立：按常规逸尾蚴方法获得日本血吸虫尾蚴，每只小鼠经腹部皮肤感染单只阳性钉螺逸出的日本血吸虫尾蚴（单性）60±2条。
　　 (2)血吸虫成虫的获得：颈椎脱臼处死小鼠，肝门静脉灌注法收集成虫，将采集的活的雄性成虫置于DMEM培养液中，每皿6条，放入37℃、5％ CO2培养箱中。
　　 (3)体外培养的血吸虫活力评分标准：3分：虫体活跃、体态柔和、颜色呈透明状；2分：活动度略差，虫体稍僵硬、颜色呈半透明状；1分：虫体仅头端或尾端活动轻微，虫体僵硬呈白色；0分：完全死亡。
　　 (4)应用本课题组测定的PZQ ED50(20.89mg/kg/只)作为亚治疗剂量，以七种不同诱导时间[5d、10d、20d、30d、60d、90d(1次/d)和10d(1次/2d)]对成虫期日本血吸虫虫体进行药物压力下的耐药性筛选。
　　 (5)应用PZQ ED50对感染日本血吸虫尾蚴3w和6w后小鼠喂饲连续给药30d，肝门静脉灌注法收集雄性成虫，加入不同浓度PZQ连续培养5d，观察虫体活力变化。
　　 (6)成虫期虫体诱导30d后再经治疗剂量PZQ连续喂饲给药5d，体外培养观察虫体对药物的敏感性变化。
　　 (7)收集日本血吸虫雄性成虫，加入不同浓度地西泮类衍生物(B3，B30，B3-O2，B3-2O2)和五羟色胺/多巴胺受体拮抗剂（利培酮、奥氮平、富马酸喹硫平）连续培养5d，观察虫体活力并影像记录。
　　 (8)扫描电镜观察虫体超微结构的变化：收集培养48h后的日本血吸虫，用生理盐水(PH7.4)冲洗3遍，放入4%戊二醛固定过夜，0.1M的磷酸盐缓冲液冲洗两次，每次10min;1%的锇酸固定1h;30%、50%、70%、80%、90%叔丁醇依次脱水，每次10min，100%叔丁醇脱水三次，放入-20℃过夜；IB-5真空离子溅射镀膜机镀金，送入S570扫描电镜（日本EDAX公司）观察。
　　 结果：
　　 (1)成虫期日本血吸虫虫体经PZQ ED50以不同诱导时间作用后，随着用药时间的延长，所筛选到的虫体对药物的敏感性呈现下降趋势，连续用药30d后的虫体对PZQ的敏感性降低最显著，表明30d是适宜的诱导时间。
　　 (2)感染6w的成虫期和感染3w的童虫期虫体经PZQ ED50连续诱导30d后，体外培养，虫体对PZQ的敏感性均显著下降，童虫期虫体经诱导后对PZQ的敏感性下降更显著。扫描电镜观察诱导后虫体的体表、抱雌沟与正常未诱导虫体相比损伤轻微，特别是童虫期诱导后虫体超微结构损伤程度更小。
　　 (3)日本血吸虫成虫经药物筛选后再用治疗剂量(200mg/kg)PZQ连续给药5d后，体外培养观察显示，虫体在不同浓度PZQ作用下存活率仍达100%，扫描电镜显示体表、抱雌沟损害比单纯用药30d的虫体轻。
　　 (4)地西泮类衍生物B3和B30在药物浓度为50μmol/L时，在体外可以导致日本血吸虫完全死亡；五羟色胺/多巴胺受体拮抗剂利培酮对日本血吸虫有一定的杀虫效应。
　　 结论：
　　 (1)在持续药物压力下，感染宿主体内不同发育阶段日本血吸虫可能对吡喹酮产生一定的耐受性，可筛选出耐药虫体，特别是在感染早期(3w)的童虫阶段，在药物压力下更易于产生耐受性，为临床用药提供实验依据。
　　 (2)地西泮衍生物B3、B30在体外抗血吸虫作用非常显著，而五羟色胺/多巴胺受体拮抗剂利培酮对日本血吸虫有一定的杀虫效应，具有潜在应用价值，值得进一步深入研究。