辛伐他汀对人肾小管上皮细胞内皮细胞蛋白C受体及血栓调节蛋白的影响

摘要

目的:慢性肾病除肾功能损害外,往往存在出、凝血的异常。出、凝血异常是慢性肾病发生发展的机制之一,了解其发生机制有助于血栓、出血并发症的治疗和预防,并影响慢性肾病的预后。在机体出凝血的过程中,抗凝系统起着非常关键的作用,蛋白C家族的内皮细胞蛋白C受体(EPCR)是抗凝系统中的重要成员之一。EPCR是新近分离纯化的蛋白,是反映血管内皮细胞功能的重要指标。EPCR与蛋白C结合,可使后者活化的效率提高4～20倍。活化的蛋白C通过灭活凝血因子起到阻止血栓形成的作用。此外,EPCR与蛋白C结合还具有抗炎功能,临床试验发现,蛋白C注射后,重症败血症死亡率明显降低。已证实,TNF-α、IL-1β等因素可以下调内皮细胞EPCR mRNA。我们通过流式细胞仪及RT-PCR方法观察人肾小管上皮细胞(HKC)上EPCR表达情况、TNF-α对EPCR的影响及辛伐他汀对HKC上EPCR和血栓调节蛋白(TM)表达的影响,探讨EPCR和TM在肾小管间质纤维化中的作用及辛伐他汀肾保护作用中的新机制。主要试验内容和结果如下:
　　 第一部分、TNF-α对肾小管上皮细胞内皮细胞蛋白C受体表达影响的研究
　　 方法：将肾小管上皮细胞(HKC)进行细胞培养,然后采用流式细胞仪技术检测培养细胞上EPCR的表达。采用不同浓度(0ng/ml、2ng/ml、10ng/ml、20ng/ml)的TNF-α作用于HKC细胞系,观察不同浓度TNF-α对EPCR基因表达的影响；同时以20ng/ml的TNF-α分别作用不同时间(3h、6h、12h、24h),观察TNF-α不同作用时间对EPCR基因表达的影响。
　　 结果：
　　 1.EPCR在HKC上有很高表达,达97.9％。
　　 2.TNF-α2ng/ml时即能明显下调细胞EPCR mRNA的表达(p<0.01),EPCR mRNA的表达随TNF-α剂量的增加而降低。
　　 3.20ng/ml的T NF-α处理HKC细胞3h时即能明显下调EPCR mRNA的表达,EPCRmRNA的表达随着作用时间的延长而降低。
　　 结论：
　　 1.人肾小管上皮细胞高表达EPCR。
　　 2.TNF-α能明显抑制HKC上EPCR,呈时间、剂量依赖性。
　　 3.EPCR表达下降可能是TNF-α等炎症因子肾损害的机制之一,EPCR可作为肾小管间质病变程度的监测指标之一。
　　 第二部分、辛伐他汀对TNF-α调节内皮细胞蛋白C受体和血栓调节蛋白作用的研究
　　 方法：将HKC细胞进行细胞培养,细胞生长至80％融合后分为三个组,第一组为阳性对照组,加入含20ng/ml的TNF-α培养基培养24h,不加辛伐他汀。第二组为空白对照组,不加任何药物培养24小时。第三组为实验组,分为三个系列,第一系列用含0.1μmol/L辛伐他汀的培养基,分别培养不同时间(3h、6h、12h)后加入含20ng/mlTNF-α的培养基,再培养24h。第二系列、第三系列培养方法与第一系列相同,但辛伐他汀浓度分别为1umol/L和10umol/L。检测各组细胞EPCR和TM的表达,观察不同浓度辛伐他汀作用不同时间对TNF-α调节内皮细胞蛋白C受体和血栓调节蛋白的作用。
　　 结果：
　　 1.20ng/ml的TNF-α能明显抑制HKC细胞中EPCR和TM的表达。
　　 2.在TNF-α和辛伐他汀共培养时,不同浓度的辛伐他汀均能显著提高肾小管上皮细胞EPCR和TM的表达,而且浓度越高,其改善EPCR和TM表达的作用越明显,呈时间依赖性；对于任何一种浓度的辛伐他汀,作用时间越长,其改善作用越明显。
　　 结论：
　　 1.TNF-α降低HKC细胞上EPCR和TM表达是肾间质纤维化的机制之一。
　　 2.辛伐他汀具有肾保护作用,提高HKC上EPCR和TM表达可能是辛伐他汀致肾间质纤维化的机制之一。