中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)肠道益生芽孢杆菌(Bacillus)的筛选、生长特性及其应用效果研究

摘要

目前水产养殖用益生菌制剂大多为陆源，筛选于水产动物肠道的报道极少，有关中华绒螯蟹肠道益生菌的筛选、生长特性及应用研究则未见报道。
　　 根据菌体对高温和低pH的耐受性、产酶能力及对病原菌的抑菌效果，对中华绒螯蟹肠道中的芽孢杆菌进行了筛选。结果表明，在筛选到的3株芽孢杆菌中，ESB3菌株抑制中华绒螯蟹病原菌嗜水气单胞菌CL99920菌株的能力最强，产蛋白酶和淀粉酶的能力也较好，在肉汤培养基初始pH3.0的条件下培养2h时，其存活率为(33.98±5.51)％，90℃水浴处理10min存活率为(68.54±8.28)％；l×108CFU/mL以下浓度的ESB3对中华绒螯蟹无毒害作用，lxl07CFU/mL的ESB3能明显提高中华绒螯蟹对嗜水气单胞菌感染的抵抗力；经形态学和生理生化反应鉴定，ESB3为地衣芽孢杆菌。研究表明，ESB3菌株具有作为中华绒螯蟹益生菌的开发潜力。
　　 以牛肉膏蛋白胨培养基为初始培养基，探讨了不同培养时间、初始pH值、温度、盐度(NaCl浓度)、转速、装液量和接种量对中华绒螯蟹源地衣芽孢杆菌ESB3生长的影响，结果表明:菌株ESB3产最大活菌数的培养条件为发酵时间20h，初始pH7.8，温度为30℃，盐度为1.5％(w/v)，转速为190r/min，装液量为30mL/250mL，接种量为9％。采用单因子试验和L9(34)正交试验优化了种子培养基的组成，结果表明，实验条件下的最佳种子培养基为:可溶性淀粉(2％)(w/v)、胰蛋白胨(2％)(w/v)、K2HP04(0.3％)(w/v)，三种成份对ESB3菌株产活菌数影响力大小顺序为K2HP04、可溶性淀粉、胰蛋白胨。以上述最佳种子培养基培养，ESB3菌株产活菌数达11.09×losCFU/mL。
　　 在基础饲料中添加不同浓度(1.3×107CFU/g、1.4×108CFU/g、0.9×109CFU/g)的活的和1.4×108CFU/g浓度的灭活的地衣芽孢杆菌ESB3，饲喂中华绒螯蟹60d，考察了地衣芽孢杆菌ESB3对中华绒螯蟹生长、肠道消化酶活性、肠道菌群及免疫力的影响。结果显示:活的ESB3菌株对中华绒螯蟹生长性能和肠道消化酶活性有不同程度的促进作用，其中中、低剂量活菌可显著提高增重率(Weight gain rate)、肠道淀粉酶(Amylase)和蛋白酶活性(Protease)(P<0.05)，中剂量活菌好于低剂量活菌，但差异不显著(P>0.05），高剂量活菌仅能显著提高肠道淀粉酶活性（p＜0.05）。活菌同样可以促进中华绒螯蟹免疫力的提高，并且基本上随着益生菌浓度的提高，各项免疫指标也随之升高，其中高剂量活菌可显著提高血细胞总数(THC)、血细胞呼吸爆发活性(02-)、酚氧化酶活性(P0)、溶菌酶活性(LSZ)、酸性磷酸酶活性(ACP)和碱性磷酸酶活性(ALP)(P<0.05)，对超氧化物歧化酶活性无显著影响(P>0.05)。中剂量活菌可显著提高血细胞总数、酚氧化酶活性、溶菌酶活性、酸性磷酸酶和碱性磷酸酶活性，对血细胞呼吸爆发活性、超氧化物歧化酶活性无显著影响（P>0.05)。低剂量活菌仅可显著提高碱性磷酸酶的活性（P<0.05）。高剂量活菌组的血细胞呼吸爆发活性、酚氧化酶活性和碱性磷酸酶活性均显著高于中剂量组（P<0.05），血细胞总数、血细胞呼吸爆发活性、酚氧化酶活性、溶菌酶活性、酸性磷酸酶和碱性磷酸酶活性均显著高于低剂量组（P<0.05）。活菌对好氧菌总数、厌氧菌总数和大肠杆菌数均无显著影响，但可显著提高芽孢杆菌数，显著降低气单胞菌数（户<0.05），以高剂量活菌效果最好，三活菌组间无显著差异(P>0.05）。灭活菌对中华绒螯蟹生长、蛋白酶和淀粉酶活力、血细胞爆发活性、酚氧化酶活性、超氧化物歧化酶活性(SOD)和肠道菌群均无影响，但可显著提高溶菌酶、酸性磷酸酶和碱性磷酸酶活性(P<0.05）。本试验条件下，ESB3活菌能明显提高中华绒螯蟹对嗜水气单胞菌的抵抗力，而灭活菌整体上无明显益生效果。
　　 总之，饲喂适量的活的地衣芽孢杆菌ESB3菌株可以促进中华绒螯蟹的生长、增强其免疫功能，是一株可以进一步加以研发和利用的益生菌。