抗血小板膜糖蛋白Ibα单克隆抗体的人源化及基于膜糖蛋白Ibα结构的活性小分子化合物研究

摘要

第一部分抗血小板膜糖蛋白Ib单克隆抗体的人源化研究
　　 研究背景：血小板膜糖蛋白(GP)Iba是血小板特异性的跨膜糖蛋白，高剪切力条件下在血管性血友病因子(VWF)的介导下与血管损伤部位暴露的胶原结合，起始血小板的黏附，进而引起血小板聚集。GPIba与VWF结合引起的血小板黏附是动脉血栓形成的关键步骤。
　　 目的：研制人鼠嵌合抗GPIba单克隆抗体，阻断VWF与GPIba的结合，为开发新型抗血小板药物提供基础。
　　 方法和结果：采用5’快速扩增cDNA末端(RACE)的方法从分泌鼠源抗人血小板膜糖蛋白GPIba单克隆抗体(SZ2)的杂交瘤细胞中分别扩增重链和轻链的可变区序列和信号肽序列，装入克隆载体后测序，经IMGT网站序列比对，确认是抗体序列后设计引物，PCR扩增后分别将重链和轻链可变区序列连同信号肽序列克隆入含有人免疫球蛋白重链Y链和轻链kappa恒定区的带有巨细胞病毒启动子的真核表达载体中。将两个表达载体共转染二氢叶酸还原酶缺陷的中国仓鼠卵巢(CHO-dhfr/)细胞后，在氨甲喋呤逐步加压下扩增抗体基因，筛选抗体高表达细胞克隆。用ELISA方法检测细胞培养上清中嵌合抗体重链及轻链的表达。我们筛选到一株高表达克隆，即3G09，1×106细胞24小时的表达量可达2.5μg。Westernblot方法检测到非还原条件下150kDa的完整抗体条带，还原条件下50kDa和25kDa的分别代表重链和轻链的条带。收集培养上清后用蛋白A柱纯化，纯化后的嵌合抗体经SDS-PAGE分离后考马斯亮蓝染色，结果同样显示非还原条件下150kDa的完整抗体条带和还原条件下50kDa和25kDa的条带，且纯度在95％以上。流式细胞术检测纯化的嵌合抗体能与表达GPIb的CHO细胞结合。纯化后的抗体用木瓜蛋白酶处理，酶切产物用蛋白A柱处理以去除未酶切完全的完整抗体和Fc片段，收集Fab片段后经SDS-PAGE分离后考马斯亮蓝染色，检测Fab纯度在90％以上。血小板聚集试验发现嵌合SZ2Fab能够抑制瑞斯托霉素诱导的血小板聚集，且抑制效果呈剂量依赖性。此外，嵌合SZ2Fab在10μg/ml派度下抑制流动小室中血小板在固定化的VWF上的黏附。
　　 结论：构建了人-鼠嵌合抗体的表达载体并在CHO细胞中成功的进行了嵌合抗体的表达；嵌合Fab片段具有潜力开发成预防和治疗动脉血栓的新型抗体药物。
　　 第二部分基于血小板膜糖蛋白Iba结构的活性小分子化合物研究
　　 研究背景：血浆VWF结合血小板GPIba是高剪切力状态下血小板黏附的起始步骤，通过GPIb的信号转导，最终导致血小板aⅡbβ3整合素的活化。
　　 目的：筛选抑制VWF与GPIba相互作用的小分子化合物。
　　 方法和结果：我们采用虚拟筛选的方法用DOCK4.0软件将SPECS化合物库中的所有小分子化合物对接到GPlbα中的VWF结合区，选取打分前149位的小分子进行实验分析，具有抑制VWF结合GPIba的小分子进一步做血小板功能的生物活性测试。我们发现其中一个化合物YC148具有抑制血浆VWF结合重组的GPlbaN端片段与免疫球蛋白Fc段融合蛋白的作用，但是有意思的是，该化合物不抑制瑞斯托霉素诱导的血小板聚集，相反，YC148本身可诱导人血小板聚集，而不依赖外源性诱导剂如瑞斯托霉素和博托霉素的存在。YC148也可诱导洗涤血小板的聚集。流式细胞术显示YC148可诱导血小板膜表面P-选择素的表达及增强单克隆抗体PAC-1结合血小板的能力。YC148诱导的血小板聚集作用可被抗血小板GPIba单克隆抗体6D1部分抑制。此外，缺乏GPlbaN端序列的血小板不能被YC148诱导聚集。
　　 结论：发现了一个新的通过GPIba诱导血小板聚集的小分子化合物，可为研究血小板黏附和聚集过程中GPIb的信号转导作用提供新的工具，也可为研究基于阻断VWF-GPIb相互作用的新型止血药提供化学结构参考。

目录

文摘

英文文摘

第一部分 抗血小板膜糖蛋白Iba单克隆抗体的人源化研究

1.1 引言

1.2 GPIb的结构与功能

1.2.1 GPIb的发现

1.2.2 GPIb/V/IX的结构

1.2.3 GPIb的在血栓与止血中的作用

1.2.4 GPIb与炎症及肿瘤的关系

1.3 抗GPIba嵌合抗体的载体构建、真核表达及功能研究

1.3.1 实验试剂与材料

1.3.2 实验方法与步骤

1.3.3 结果

1.3.4 分析与讨论

1.3.5 结论

1.4 参考文献

第二部分 基于血小板膜糖蛋白Iba结构的活性小分子化合物研究

2.1 引言

2.2 虚拟筛选概述

2.3 GPIba的分子对接研究

2.3.1 大分子结构处理

2.3.2 小分子化合物结构处理

2.3.3 活性位点的描述

2.3.4 DOCK4.0对接结果分析

2.4 生物学活性分析

2.4.1 重组Gplba-Fc融合蛋白的真核表达、纯化及鉴定

2.4.2 ELISA检测小分子化合物对VWF结合重组GPIba片段的影响

2.4.3 血小板聚集实验

2.4.4 流式细胞术

2.5 结果与讨论

2.5.1 重组Gplba-Fc融合蛋白的真核表达、纯化及ELISA鉴定

2.5.2 YC148抑制VWF结合重组的Gplba片段

2.5.3 YC148诱导血小板聚集和活化

2.5.4 YC148结合Gplba的特异性研究

2.5.5 GPIbaN端缺陷的血小板对YC148反应性的研究

2.6 结论

2.7 参考文献

全文总结

研究生期间发表的论文和获奖情况

致谢