siRNA沉默HIF-1α基因对前列腺癌PC3细胞生物学行为及多西紫杉醇化疗和放疗敏感性的影响

摘要

前列腺癌是泌尿生殖系最常见的恶性肿瘤之一，主要治疗手段有根治性手术和内分泌治疗、放疗及化疗。根治术后局部复发或远处转移及许多无手术机会的患者，常选择内分泌治疗。接受内分泌治疗的患者，大多数起初有效，但经过中位时间14～30个月后，几乎都将逐渐发展为激素非依赖性前列腺癌或激素难治性前列腺癌，激素治疗将不再有效。如何有效地治疗激素非依赖性前列腺癌或激素难治性前列腺癌依然是基础和临床研究的热点和难点。RNA干扰(RNAi)是利用小RNA(包括小干扰RNA即siRNA)序列抑制特定基因信号的过程，直到目前，尚未发现哺乳动物有内源表达的siRNA。若能将人工合成的具有特定序列的siRNA导入肿瘤细胞内，有可能引起具有同源序列基因的mRNA降解，从而有效地抑制该基因的表达，影响肿瘤的生物学行为。近年来，RNAi技术的发展为前列腺癌治疗的研究提供了一种新思路。包括前列腺癌在内的肿瘤细胞对放化疗等治疗措施的敏感性与组织是否缺氧有关。缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)调控的众多下游基因参与了血管生成、血红蛋白的合成、葡萄糖转运和糖酵解、细胞的增殖与凋亡等肿瘤乏氧适应的生物学过程。文献报道和我们的前期研究证实：前列腺癌中HIF-1α在mRNA水平和蛋白水平均呈高表达，且与前列腺癌的恶性生物学行为有关。本课题设计思路：首先，体外化学合成7条siRNA，通过脂质体包裹后转染前列腺癌PC3细胞，观察HIF-1α-siRNA的干扰效果，筛选出最有效的siRAN，然后用它来进行RNAi以观察对PC3细胞生物学行为如生长增殖、侵袭迁移及凋亡等的影响，再联合多西紫杉醇化疗及放疗来观察siRAN沉默HIF-1α对PC3细胞化疗及放疗的敏感性的影响，以期为前列腺癌的治疗提供一种新思路。本研究分四个部分：
　　 第一部分：设计、合成靶向HIF-1α基因的siRNA序列，并筛选出最有效的序列，为后续研究提供依据。
　　 方法：针对人类HIF-1α基因mRNA(NM_001530)序列设计并化学合成七条siRNA及两条阴性对照序列。选择40nM作为siRNA的转染终浓度，转染后24、48、72小时用Real-Time-PCR检测PC3细胞HIF-1α-mRNA表达水平的变化；在siRNA转染后48小时用western-blotting检测PC3细胞HIF-1α蛋白表达水平的变化。
　　 结果：1号及5号序列HIF-1α-siRNA转染24小时后的干扰效果在所有序列中较好，mRNA抑制率均在70[％]以上。HIF-1α-siRNA干扰的时效性检测显示1号序列及5号序列在mRNA水平干扰效果最佳的时间是转染后24～48小时。转染后48小时western blot检测HIF-1α蛋白水平，结果显示序列1干扰效果最好，蛋白水平下降了70[％]以上。
　　 结论：7条HIF-1α-siRNA中，靶位点为792-812的1号HIF-1α-siRNA转染48小时后在mRNA水平和蛋白水平的干扰效果均较好，抑制率均在70[％]以上；因此确定用1号HIF-1α-siRNA来进行后续研究。1号HIF-1α-siRNA最好的干扰效果可能发生在转染后24～48小时左右。
　　 第二部分：探讨用1号siRNA(HIF-1α-siRNA1)沉默HIF-1α基因对前列腺癌PC3细胞生物学行为的影响。
　　 方法：实验分为PC3组、PC3+NC siRNA组和PC3+HIF-lα-siRNA1三组；采用脂质体包裹已被证实有效的HIF-1α-siRNA1转染PC3细胞；用CCK-8法测各组PC3细胞生长增殖情况；划痕试验法观察细胞的迁移能力；Transwell法观察细胞的侵袭力；流式细胞术Annexin V-FITC/PI法测量细胞的凋亡率。
　　 结果：⑴CCK-8法检测发现转染后24、48、72、96小时PC3+HIF-lα-siRNA1组细胞存活率明显低于PC3组和PC3+NC siRNA组(P<0.05)，两对照组无显著性差异(P>0.05)；48h～72h抑制作用最明显。⑵划痕法测定显示PC3+HIF-lα-siRNA1组细胞迁移能力明显低于对照组(P<0.01)；两对照组无显著性差异(P>0.05)。⑶Transwell测定显示：PC3+HIF-lα-siRNA1组穿过Matrigel胶的细胞数明显少于PC3组和PC3+NC siRNA组(P<0.01)，两对照组无显著性差异(P>0.05)。(4)转染后48小时空白对照组、阴性对照组、干扰组PC3+HIF-lα-siRNA1组凋亡率分别为2.4[％]、2.5[％]、11.2[％]，干扰组凋亡率明显高于对照组(P<0.01)。
　　 结论：①沉默HIF-lα基因抑制了PC3细胞的生长；②沉默HIF-lα基因降低了PC3细胞的迁移力和侵袭力；③沉默HIF-lα基因对PC3细胞的凋亡有促进作用。
　　 第三部分：观察siRNA沉默HIF-1α基因对PC3细胞多西紫杉醇化疗敏感性的影响。
　　 方法：实验分为PC3+DTX组、PC3+NC siRNA+DTX组和PC3+HIF-lα-siRNA1+DTX三组，每组另外设一个未化疗的平行对照组。转染后24小时起给予终浓度为0.25μM多烯紫杉醇，CCK-8法测各组细胞生长增殖变化；流式细胞术检测细胞的凋亡率和细胞的周期分布，并检测多药耐药基因蛋白的表达。
　　 结果：化疗48小时后PC3+HIF-lα-siRNA1+DTX组细胞存活数明显低于PC3+DTX组和PC3+NC siRNA+DTX组 (P<0.01)，两化疗对照组间无显著性差异。化疗后48小时PC3+DTX组、NC siRNA+DTX组、PC3+HIF-lα-siRNA1+DTX凋亡率分别为15.6[％]、14.8[％]、21.3[％]，PC3+HIF-lα-siRNA1+DTX组凋亡率高于对照组(P<0.01)。流式细胞仪测定化疗后48小时各组PC3细胞的周期分布，结果显示未化疗的HIF-lα-siRNA1转染组PC3细胞发生了G0/G1期阻滞解除。PC3+DTX组、NC siRNA+DTX组、PC3+HIF-lα-siRNA1+DTX组PC3细胞化疗前与化疗后48小时多药耐药基因蛋白表达均无差异。
　　 结论：HIF-lα-siRNA1转染能增加PC3细胞对多烯紫杉醇化疗的敏感性。沉默HIF-lα基因对PC3细胞多烯紫杉醇的化疗增敏作用与凋亡率升高及G0/G1期阻滞解除有关，但与多药耐药基因蛋白的表达无明显相关。
　　 第四部分：观察siRNA沉默HIF-1α基因对前列腺癌PC3细胞的体外放射治疗作用的影响，并初步探讨可能涉及的机制。
　　 方法：实验分组同前。采用细胞增殖克隆形成法测定不同剂量放射治疗后的克隆形成数，经单靶多击模型分析计算D0、准阈剂量Dq、2Gy时的存活率SF2、外推值N、放射增敏比SER，绘制细胞放射剂量-存活曲线。CCK-8法测定各组PC3细胞单次6Gy照射后不同时间的存活曲线。流式细胞术分析各组PC3细胞放疗后72小时的凋亡率和放疗前及放疗后72小时的细胞周期分布。
　　 结果：⑴RADIOMED软件分析显示PC3+HIF-lα-siRNA1组D0、SF2、Dq、N值均低于PC3组和PC3+NC siRNA组，以D0计算，PC3+HIF-lα-siRNA1组相对于PC3组的放射增敏比SER为1.24。⑵方差分析CCK-8法测定结果显示放疗24h以后PC3+HIF-lα-siRNA1组细胞生长明显慢于PC3组、PC3+NC siRNA组(P<0.01)，两对照组间无明显差异(P>0.05)。⑶6Gy放射治疗后72小时流式细胞仪测定显示PC3组与PC3+NC siRNA组间细胞凋亡率无明显差异(P>0.05)。PC3+HIF-lα-siRNA1组凋亡率较高，与两对照组比较有明显差异(P<0.01)。⑷流式细胞仪测定放疗前和6Gy单次放射治疗后72小时各组PC3细胞的周期分布，结果显示放疗前HIF-lα-siRNA1转染组PC3细胞发生了G0/G1期阻滞解除。
　　 结论：①HIF-lα-siRNA1沉默HIF-lα基因的表达增强了PC3细胞的放射敏感性。②沉默HIF-lα基因引起的放射增敏作用可能与放疗后PC3细胞的修复力下降、氧化应激损伤增加、凋亡率升高及G0/G1期阻滞解除有关。