体外培养皮肤种子细胞复合高分子支架原位修复深度烧伤创面的研究

摘要

组织工程的原理是利用生物学和工程学的方法，再生缺损的组织或者器官。烧伤临床救治的关键是创面的修复和皮肤再生，如何及时、有效地封闭烧伤创面并完整的再生创面皮肤是烧伤治疗的根本任务。自体皮肤移植是治疗深度烧伤创面的金标准，但大面积、特大面积烧伤后，自体皮源严重不足常危及病人的生命，所以组织工程皮肤的研究和开发成为烧伤工作者多年来梦寐以求的目标。1975，Rheinwald等建立了表皮细胞体外培养方法。随后，表皮细胞膜片培养与移植技术为大面积深度烧伤病人提供了充足的皮源，提供了烧伤创面修复的新方法，为皮肤组织工程奠定了基础。
　　 体外培养表皮细胞膜片的成功研究和开发提示研究者，以自体细胞作为组织工程皮肤的种子细胞理论上能够无限量再生自体皮肤，而且还可以避免免疫排斥作用；临床治疗过程中，为大面积烧伤患者节省了皮源，提高了存活率。另一方面，随着生物材料学的不断发展，将具有特定功能或分化潜能的种子细胞与可降解生物材料(支架材料)共植入体内，随着种子细胞的不断扩增、细胞外基质的分泌和生物材料的逐渐降解、吸收，最终形成具有正常皮肤结构或接近正常皮肤结构人工皮肤。种子细胞和支架材料成为组织工程研究的主要内容。在组织工程的研究与应用中，种子细胞的来源、分离纯化、规模化扩增等是制约其发展的重要瓶颈问题之一；支架材料应当具有适宜的降解速率，使支架材料在一定时间内吸收；以及良好的组织相容性，形成具有功能活性的皮肤组织。故理想的支架材料是组织工程皮肤的另一个关键。丝素蛋白作为应用生物医用高分子，具有优良的生物相容性、缓慢生物降解性能、独特的力学性能和低致敏性，而且来源于天然蚕丝，易获取且价格低廉；丝素蛋白作为生物材料得到了广泛的研究和应用，如将丝素蛋白膜作为伤口敷料，比合成高分子膜具有更好的透气性；众多研究表明丝素蛋白是一种较理想的构建组织工程皮肤的生物材料。
　　 本研究利用三种不同性质的细胞(效能细胞，单能干细胞，多能干细胞)作为组织工程皮肤的种子细胞，联合高分子支架材料丝素蛋白膜构建组织工程皮肤，来修复皮肤缺损创面-模拟的深度烧伤切痂创面。本研究的目的在于探索以组织工程皮肤修复深度烧伤创面的新方法，以期解决大面积深度烧伤创面临床救治的棘手问题。研究思路为体外分离培养纯化种子细胞，并进行相应的细胞表型鉴定，联合高分子支架移植于创面共培养，在深度创面原位再生皮肤表真皮结构，而修复创面。本研究以组织工程种子细胞联合高分子支架材料，原位修复了深度创面并再生皮肤，为组织工程皮肤用于大面积深度烧伤临床救治提供参考及方法。
　　 第一部分
　　 目的：探索以体外培养自异表皮细胞混合悬液原位移植，修复深度烧伤创面的新方法，并对其过程和机制进行探讨。
　　 方法：体外分离和培养自、异体表皮细胞，将两种细胞的混合悬液移植到异体皮覆盖下的深度烧伤创面，观察表皮细胞的增殖和转移过程、创面上皮化过程、异体皮的坏死和脱落过程以及创面的封闭过程。动物实验以SD(Sprague-Dawley)大鼠作为实验动物，通过切割法在大鼠背部制作Ⅲ°皮肤缺损创面。考察体外培养自、异体表皮细胞移植在创面再生表皮的作用，并以体外培养自体表皮细胞膜片作为对照。在此基础上，选择临床Ⅲ°烧伤创面病例，研究体外培养人体自、异体表皮细胞对Ⅲ°创面的修复和上皮化作用。
　　 结果：动物实验：体内原位培养2～3周后见皮肤缺损创面被表皮细胞覆盖，表面光滑，与皮下连接紧密，无松动，切片见3～4层细胞，且有许多皮钉样结构深入皮下、肌肉。临床应用：混合表皮细胞悬液移植后3～4周，渐融合成片，外盖的异体皮肤脱落，伤口渐愈合。3、6个月随访表明愈合后的创面平整、轻度瘢痕、无排异反应。
　　 结论：动物实验表明自、异体表皮细胞混合悬液能够在烧伤创面原位完整地再生表皮，封闭烧伤创面。临床应用也表明，自、异体表皮细胞能够Ⅲ°创面增殖和转移，形成上皮岛并融合，促进创面上皮化。
　　 第二部分
　　 目的：探讨表皮干细胞联合成纤维细胞-丝素蛋白纳米纤维活性支架，对Ⅲ°创面的修复和再生作用。
　　 方法：采用快速贴壁法分离和培养表皮干细胞(Epidermal Stem Cell，ESC)。将表皮干细胞分别在经丝素蛋白修饰的和未经修饰的培养瓶，以及悬浮培养，研究了表皮干细胞的生长特性；以β1整合素和细胞角蛋白CK19免疫荧光染色实验验证细胞类型；体外构建了成纤维细胞-丝素蛋白纳米纤维活性支架；在SD大鼠背部制作模拟Ⅲ°烧伤切痂创面，以体外培养的自体表皮干细胞联合成纤维细胞-丝素蛋白纳米纤维活性支架移植入创面，研究此组织工程皮肤原位修复烧伤创面的过程并以凡士林纱布敷料作为对照组创面。
　　 结果：以快速贴壁法能够有效地分离得到表皮干细胞；表皮干细胞在经丝素蛋白修饰的培养瓶和未经蛋白修饰的培养瓶的生长趋势大于悬浮培养组；免疫荧光染色结果发现细胞表面β1整合素和角蛋白CK19阳性，证实分离得到的细胞为表皮干细胞。成纤维细胞能够在丝素蛋白纳米纤维中扩增并分泌细胞外基质，最终与丝素蛋白纳米纤维形成活性支架。表皮干细胞联合成纤维细胞-丝素蛋白纳米纤维活性支架能够修复SD大鼠Ⅲ°创面，与凡士林纱布相比，其对创面的愈合时间缩短，愈合效率提高，并且完整的再生皮肤的表真皮结构。
　　 结论：以表皮干细胞联合成纤维细胞-丝素蛋白纳米纤维支架能够修复Ⅲ°创面，并且完整的再生皮肤表真皮结构，
　　 第三部分
　　 目的：探讨骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells BMSCs)分化为表皮细胞和血管内皮细胞的能力以及联合丝素蛋白材料(silk fibroin，SF)修复大鼠全层皮肤缺损，以评价BMSCs和SF材料在皮肤组织工程中的应用价值及其机制。
　　 方法：分离培养人骨髓间充质干细胞，体外诱导分化为表皮细胞和血管内皮细胞，通过免疫组织化学染色和免疫荧光染色鉴定；应用BrDU标记鼠BMSCs并联合SF材料移植到大鼠全层皮肤缺损创面，27只健康纯种Sprague-Dawley大鼠，在其背部切除直径为3cm圆形全厚皮肤，实验组移植BrDU标记的鼠BMSCs构建的组织工程皮肤(18只)；空白对照组不作处理(9只)。实验组分别于术后1d、2d、4d、6d、8d、2w、4w、6w、8w处死2只动物，对照组相同时间点处死1只动物观察。立即取材对创面愈合情况加以动态观测和分析，比较2组皮肤缺损修复的情况。
　　 结果：诱导前BMSCs呈典型的成纤维样间充质细胞形态，诱导7天以后，胞体逐步回缩，立体感增强，免疫组织化学染色及免疫荧光染色结果显示，表皮细胞标志物CK19、CK10以及血管内皮细胞标志物KDR、FLT-1、v-WF不同程度阳性。实验动物均存活至实验完成，术后4周对照组创面约40％皮肤发黑、结痂、坏死；术后8周仍可见坏死组织，且瘢痕挛缩明显。术后4周实验组创面皮肤成活，外观平整有弹性，表皮角化明显，无明显瘢痕形成，HE染色见表皮可明显区分基底层、棘层、颗粒层和角质层，表皮突明显，真皮层可见较多成纤维细胞，免疫荧光染色显示带有BrDU标记的BMSCs定位在重建的表皮和真皮组织中，表皮主要定位于其基底膜附近，真皮层亦可见BrDU标记的BMSCs。术后8周创面愈合良好，HE染色见表皮层细胞增多，角质层增厚；真皮层成纤维细胞增多，胶原纤维减少。
　　 结论：骨髓间充质干细胞在体外可以诱导分化为表皮细胞和血管内皮细胞，SF材料与BMSCs联合移植能够修复大鼠皮肤缺损，可以作为组织工程皮肤的支架材料和种子细胞的来源。