宽体金线蛭抗凝物质的分离纯化及理化性质研究

摘要

水蛭始载于《神农本草经》,历代本草均有记述。中医认为水蛭具有破血、逐瘀、通经之功能。近年来,它的医用研究越来越广泛,特别是水蛭中提取的抗凝物质,目前研究最多的是水蛭素。中国药典(2000版)收录的三个水蛭品种中,宽体金线蛭(Whitmania pigraWhitman)使用最广泛,并且在我国广泛养殖,另外两个品种:日本医蛭、柳叶金线蛭在我国养殖数量很少,现在药厂使用的多数是宽体金线蛭。而关于宽体金线蛭活性成分国内报道研究的很少,关于宽体金线蛭中抗凝物质的序列更是没有报道。为了进一步探讨其抗凝作用的物质,本试验采用宽体金线蛭作为实验材料,对其含有的抗凝物质进行分离纯化并进行序列测定。
　　 本研究首先采用宽体金线蛭的鲜品与干品作为实验材料,用丙酮.三氯乙酸法和三氯乙酸法进行粗提。结果表明：采用干品宽体金线蛭作为粗提材料,丙酮.三氯乙酸法作为提取方法时,每克材料所得的粗品质量0.394g,所得粗品比活力1.961IU3/mg。与采用干品作为实验材料,三氯乙酸法作为实验方法相比,每克材料所得到粗品质量与比活力均比后者要高；当用鲜品作为实验材料时,无论采用哪种方法,所得粗品质量及比活均小于以干品作为实验材料的质量及比活。因此本试验采用干品宽体金线蛭作为实验材料,丙酮.三氯乙酸法作为粗提方法。为分离得到单一蛋白质并对提取方法进行优化,本试验采用不同柱填料进行分离。采用Sephadex G-50时总活力回收率是52.174％,纯化倍数18.390;采用Sephadex G-75时总活力回收率是59.627％,纯化倍数8.294。在总活力回收率与吸收峰相近情况下,Sephadex G-50纯化倍数要高于Sephadex G-75,因此我们采用Sephadex G-50作为凝胶过滤层析柱填料。对凝胶过滤层析得到的抗凝物质进行离子交换分离并且对不同柱填料进行比较,结果表明:两种不同柱填料DEAE—Separose CL-6B和DEAE-cellulose DE-52相比,DEAE-Separose CL-6B回收率与纯化倍数(88.71％,1.36)均大于DEAE-cellulose DE-52(68.98％,1.117),并且DEAE-Separose CL-6B分离后电泳结果显示只有两个蛋白质条带,DEAE-celluiose DE-52有三条蛋白条带,因此采用DEAE-Separose CL-6B作为离子交换层析的柱填料。将阴离子交换得到的抗凝物质进行Sep-pak C18柱分离,经过SDS-PAGE电泳结果显示,只有单一条带,说明分离得到的抗凝物质是电泳纯的单一肽链,分子量大约为14.9KD。对所得抗凝物质进行双向电泳,只得到一个电泳斑点,初步推算其等电点.5.9。最后将所得的抗凝物质PVDF转膜,N端序列测定。根据等电点、分子量及测序结果分析,我们提取得到的抗凝物质是一种新的蛋白质。对分离得到的抗凝物质进行理化性质分析,结果表明分离纯化得到的抗凝物质是一种非常稳定的蛋白质。温度升高(100℃水浴)和pH(1—13)的改变不影响其活力。在某些变性剂(1％SDS、0.1mol/l DTT。和25％三氟乙酸)存在条件下也非常稳定。0.1％的DTT70℃加热1h才使活力部分丧失。只有pH和温度同时升高其活力才开始下降,pH12、80℃条件下处理15min即可使其活力基本丧失。本实验为宽体金线蛭进一步临床应用提供了一定的科学依据:对宽体金线蛭入药机理研究提供了理论基础；首次报道宽体金线蛭中抗凝物质的序列,为以后进一步研究打下了基础。

目录

文摘

英文文摘

前言

第一章 综述

1 水蛭生态分布、分类、形态以及习性

2 水蛭研究历史以及药用价值

3 水蛭化学成分

4 凝血、抗凝、纤溶系统和抗凝剂

5 水蛭药理作用

6 研究的目的及意义

第二章 宽体金线蛭抗凝物质分离纯化及分子量测定

1 材料和仪器

1.1 实验材料

1.2 常用仪器设备

2 主要试剂配制

3 实验方法

3.1 粗提物初步分离及方法比较

3.2 粗提物层析分离与优化

3.3 抗凝物质分子量测定

4 结果

4.1 粗提物初步分离结果

4.2 粗提物层析分离结果

4.3 抗凝物质分子量测定结果

5 讨论与分析

第三章 抗凝物质理化性质鉴定

1 材料与仪器

1.1 实验材料

1.2 实验仪器

2 主要试剂的配制

3 实验方法

3.1 抗凝物质等电点测定

3.2 抗凝物质序列分析

3.3 molish反应与茚三酮反应

4 结果

4.1 等电点测定结果

4.2 序列分析结果

4.3 molish反应与茚三酮反应结果

5 讨论与分析

第四章 抗凝物质稳定分析

1 材料与仪器

1.1 实验材料

1.2 实验仪器

2 主要试剂配制

3 实验方法

2.1 抗凝物质各种条件稳定行分析

2.2 温度和pH对抗凝物质活力的影响

4 结果

4.1 抗凝物质在极端pH、高温、变性剂的稳定性

4.2 温度和pH对抗凝物质活性影响

5 讨论

第五章 结论

参考文献

研究生期间科研成果

致谢