谷胱甘肽在产朊假丝酵母抵抗氧应力的作用

摘要

产朊假丝酵母(Candida utilis)是一株重要的工业生产菌株,已被美国FDA认证为可作为食品添加剂的酵母。然而,在利用假丝酵母过量合成目标发酵产物的过程中,会不可避免地遇到氧,氧在还原过程中会形成活性氧,如超氧阴离子(O2-)、羟基自由基(OH·)和过氧化氢(H2O2)。过量的活性氧会攻击蛋白质,脂肪酸和核酸,形成氧胁迫,从而加速细胞的老化和死亡,因此,本文试图研究产朊假丝酵母对氧胁迫的响应和调节机制,降低氧胁迫引起的负面效应,增强生产菌株适应或抵抗氧胁迫的能力,从而提高目的产物的产量。谷胱甘肽(GSH)是一种非蛋白巯基化合物,由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸在γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(gsh1基因编码)和谷胱甘肽合成酶(gsh2基因编码)的催化下缩合形成,广泛存在于自然界生物体中。有研究表明,GSH在维持细胞内氧化还原环境及抗氧化的过程中起着重要的作用。为了进一步研究GSH在产朊假丝酵母中是否具有抗氧化的生理功能,本文首先从产朊假丝酵母中克隆了gsh1,其次构建了适用于产朊假丝酵母的敲除系统,然后通过基因敲除,获得了gsh1和gsh2缺失突变体菌株,并对其进行H2O2胁迫,研究GSH的生理功能。
　　 ⑴根据不同种属酵母菌Y-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)蛋白质的保守序列,获得相对保守序列,用CODEHOP在线设计引物,获得部分gsh1基因序列,以Candida utilis基因组为模板,对获得的部分gsh1基因序列进行染色体步移,最终克隆了C.utilis&SZU07-01的gsh1基因,并提交NCBI,序列号为HQ171204。
　　 ⑵报道一种适用于产朊假丝酵母的基因敲除系统,利用该敲除系统成功地获得gsh1基因敲除杂合突变株。以商品化质粒pPICZalpha A为基础,构建了gsh1基因的敲除载体pPICZalphaA-kan3。在该质粒中,kan基因的启动子TEF被替换为来自于C utilis SZU07-01的GAP启动子(pGAP:kan)。待质粒线性化后电转化C.utilis,成功获得了gsh1基因敲除杂合突变株C.utilis GSH.6(gsh1△)。结合发酵培养得到的数据进行分析,发现突变株的γ-GCS酶活比出发菌株降低17.5％,GSH合成量降低61％,细胞干重降低18.5％。所构建敲除组件pGAP:kan的成功应用为从分子水平研究C.utilis中GSH的生理功能提供了可能。在构建了基因敲除系统的基础上,进一步构建了质粒pPICZalphaA—zeocin,pPICZalphaA-CYH和pPICZalphaA-HPH,分别获得了gsh1基因敲除突变体GSH-3(gsh1Δ2)和GSH-9(gsh1Δ3),构建了质粒pPICZ-gsh2-kan和pPICZ—gsh2-zeocin,获得了gsh2基因敲除突变体GSH2(1)(gsh2Δ)和GSH2(2)(gsh2Δ2),为在产朊假丝酵母中进行遗传操作提供了很好的借鉴。
　　 ⑶研究GSH在产朊假丝酵母中抵抗氧胁迫的生理功能,首先在没有H2O2胁迫下,对菌株C.utilis SZU07-01、GSH-3和GSH2(2)进行摇瓶发酵分析,结果发现,与出发菌株SZU07-01相比,GSH-3,GSH2(2)胞内GSH浓度分别降低了89％和53％,总GSH浓度分别降低了64％和29％,但干重增加了10％和11％,GSH合成量的降低,可能是由于菌株gsh1和gsh2拷贝数的降低,细胞内γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶和谷胱甘肽合成酶表达的减少而引起的。同时菌株GSH-3,GSH2(2)中细胞干重增加也表明,在没有胁迫条件下,GSH合成的减少对细胞生长没有明显影响。其次,研究了H2O2胁迫条件下,菌株C.utilis SZU07-01、GSH-3和GSH2(2)的应对机制。对出发菌株SZU07-01添加H2O2进行胁迫,发现发酵18 h添加10mmol／L H2O2,细胞内GSH合成增加,表明细胞可能通过增加GSH的合成来应对H2O2胁迫。然后,我们对菌株GSH-3和GSH2(2)在18 h添加10 mmol／L H2O2进行胁迫,结果GSH-3和GSH2(2)中总的GSH浓度分别也增加了22％和1％,验证了细胞可能通过增加GSH的合成来应对H2O2胁迫,同时GSH-3和GSH2(2)的细胞干重降低了6％和9％,表明细胞在gsh1和gsh2拷贝数的减少时对H2O2诱导的氧胁迫更加敏感。菌株GSH-3和GSH2(2)中过氧化氢酶(CAT)的酶活分别增加了7％和12％,表明CAT可能在抵抗H2O2的胁迫的过程中也起着一定的作用。