用于真皮重建的丝素/硫酸软骨素/透明质酸共混支架的研究

摘要

自体皮移植仍然是目前临床治疗因深度烧伤等原因造成的真皮组织缺损的主要手段，但由于供皮区不足且对患者造成二次伤害，迫切需要同时具备促真皮修复活性和生物可降解性的新型真皮支架。国内外的研究已初步证明丝素蛋白(SF)用作真皮组织的再生支架有良好的潜力。若能进一步增强其调节细胞行为的能力，并使其降解速率与真皮组织的再生速率更好地匹配，则它将更能满足真皮组织再生的需要。因此本文在SF多孔支架中引入透明质酸(HA)和硫酸软骨素(CS)，制备SF/CS/HA共混多孔支架材料，研究多孔支架的制备条件与结构及理化性能之间的关系；在此基础上，通过体外及体内实验，研究在SF中引入HA和CS后，对细胞行为的调节作用，以及促进真皮组织修复的活性及其机制。
　　 首先，用冷冻干燥法制备SF/CS/HA共混多孔支架，系统地研究了多孔支架的结构及理化性能，结果表明，SF/CS/HA共混多孔支架以无定形结构为主，含有β-折叠结构；SF/CS/HA共混支架材料的吸水性和拉伸强度比SF材料显著增大。SF多孔支架中引入HA后，SF/CS/HA共混多孔支架的平均孔径由于HA抑制冰晶的成长而有所减小，可以在95-248μm之间调节。由于HA大分子链的空间网络结构，材料干燥过程中能较好地保持形态的稳定性，收缩率小，所以多孔支架的孔隙率随着HA所占比例的的增大而增大，可在89-93％之间调节。在SF多孔支架中引入HA后，材料的酶降解速率减慢。
　　 其次，根据激光共聚焦显微镜、SEM、组织学及MTT法观测结果，在SF多孔支架中引入CS和HA后，能明显地促进L929细胞的粘附和增殖。当SF/CS/HA共混比例为80/5/15时，细胞增殖最快，伸展最好，最有利于细胞的生长。
　　 进一步，通过将SF、SF/HA(80/20)、SF/CS/HA(80/5/15)三种多孔支架植入SD大鼠背部真皮缺损部位，进行引导真皮再生的体内试验观察，结果显示三种材料内均无明显的炎症细胞浸润，材料引起的机体免疫应答和炎症反应轻微。材料均能良好地与周围组织融合。组织修复细胞均能迁移进入材料内部，并以不同的速率构建真皮组织。在真皮组织的修复重建过程中，比较了三种不同多孔支架对大鼠背部真皮缺损的引导再生效果，结果显示，在SF多孔支架中引入CS和HA后，制备的SF/CS/HA(80/5/15)共混支架，植入真皮缺损部位后的炎症反应轻微，能够加快毛细血管生成和组织新生，从而使组织新生率与材料的降解率更好地匹配。Masson’s染色结果显示，随着修复时间的延长，SF/CS/HA共混多孔支架内胶原纤维的生成量明显比SF和SF/HA多孔支架内多。
　　 最后，为了研究多孔支架促进创面愈合的机制，经多指标测试和分析表明，在创面修复重建的前期，SF/CS/HA共混多孔支架内CD34、PDGF、VEGF和bFGF都比SF和SF/HA多孔支架有较高的阳性表达率，这进一步说明SF/CS/HA共混支架具有促进创面血管生成和真皮重建的活性的同时，也表明产生这一活性的分子生物学机制是刺激PDGF、VEGF和bGFG的生成并富集这些生长因子，同时为组织修复细胞的迁移、粘附、生长及功能发挥创造良好的微环境。
　　 通过本文的研究，阐明了在SF多孔材料中引入CS和HA后，对材料结构和性能的调节作用，发现SF/CS/HA(80/5/15)多孔支架具有明显的促进血管生成及促进真皮组织修复的活性，揭示了其机制，为皮肤真皮组织的修复重建提供了一种新的材料。