Sox9基因修饰人脐带间充质干细胞向软骨细胞分化的实验研究

摘要

目的：构建人Sox9基因慢病毒载体，体外Sox9幔病毒载体转染人脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)，观察Sox9基因转染对hUC-MSCs生物学特性的影响，以及经Sox9基因修饰的hUC-MSCs在单层培养条件下向软骨细胞分化的能力，为软骨组织损伤及退变性疾病的细胞学及基因治疗提供实验依据。
　　 方法：通过PCR的方法获得人Sox9基因编码区片段，将该片段克隆入慢病毒载体Pwpxl-MOD中产生Pwpxl-MOD/Sox9，通过酶切测序鉴定慢病毒载体，将Pwpxl-MOD/Sox9、pRsv-REV、pMD1g-pRRE、pMD2G共转染293T细胞，包装成含有Sox9基因的重组慢病毒。采用酶消化法从人脐带基质中获取间充质干细胞，流式细胞仪进行细胞表型鉴定，诱导向成骨、脂肪分化以观察其多向分化潜能。包装好的慢病毒体外转染hUC-MSCs，利用荧光倒置相差显微镜观察转基因细胞的形态变化、绿色荧光表达(GFP)情况，转染后48h确定基因转染效率。逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法及免疫印迹(Western-blot)检测Sox9在huC-MSCs中的表达；四甲基偶氮唑盐比色法(MTT)法测定慢病毒对细胞增殖能力的影响。在高密度单层培养条件下，不增加生长因子、地塞米松等软骨诱导液，将Sox9基因修饰的hUC-MSCs培养分化21d，RT-PCR、Western-blot、免疫组化及免疫荧光染色、阿利新兰染色检测特异性软骨细胞分子标志Ⅱ型胶原、Agrrecan的表达以及蛋白多糖的分泌情况。
　　 结果：酶切、测序鉴定证实慢病毒载体Pwpxl-MOD中插人片段为基因Sox9。经检测包装好的慢病毒滴度为6.0×107TU/ml；从人脐带基质分离出的hUC-MSCs形态类似于成纤维样细胞，CD29(95.9％)、CD44(96.5％)表达阳性，CD34(3.O％)、CD45(2.6％)造血干细胞表型标志表达为阴性。向脂肪及成骨方向诱导培养21d，油红O染色、碱性磷酸酶染色、Von kossa染色均为强阳性，表明hUC-MSCs具有较强的多向分化潜能。基因转染48h后观察到较强的绿色荧光表达，Lenti-GFP-Sox9及Lenti-GFP的转染率均达到90％以上。RT-PCR、Western-blot检测到目的基因Sox9在hUC-MSCs中出现过表达(P<0.001)，细胞生长曲线显示转染对hUC-MSCs的增殖活力无明显影响(P>0.05)。Sox9基因修饰的hUC-MSCs在单层培养下7d开始出现自发性的细胞聚集现象，到14d细胞集聚明显增大，21d左右，有较大的软骨结节形成。而Lenti-GFP及未转染的细胞无明显的细胞集聚现象产生。RT-PCR、Western-blot、免疫组化及免疫荧光染色检测到Ⅱ型胶原、Agrrecan有较高水平的表达，阿利新兰染色示大量的蛋白多糖的在软骨结节中结聚。
　　 结论：1、成功构建了含有Sox9基因慢病毒载体。2、人脐带间充质干细胞体外培养扩增容易，具有多向分化潜能，易于被外源性基因修饰。2、在单层培养条件下，无生长因子及其他软骨诱导因子的刺激的情况下，经Sox9基因修饰的HU-MSCs具有较强的向软骨细胞分化的能力，表明Sox9基因在促进间充质干细胞向软骨细胞分化过程中发挥了重要的作用。