慢病毒介导强制泛素化HBcAg基因修饰小鼠髓源性树突状细胞体外诱导细胞毒性T淋巴细胞反应

摘要

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)的慢性感染仍然危害人类健康，全球大约有3.5亿人感染HBV，部分患者最终进展为肝硬化、肝细胞癌。目前尚无有效的方法彻底清除患者体内的乙肝病毒。特异性的细胞免疫反应在控制HBV的感染中起关键性作用，通过抗原刺激产生特异性细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocytes，CTL)是清除慢性HBV感染者体内病毒的一个有效途径。
　　 泛素-蛋白酶体系统(ubiquitin-proteasome system，UPS)是一种广泛存在于真核细胞内依赖ATP的高选择性蛋白质降解体系，它由泛素(ubiquitin，Ub)、泛素活化酶(ubiquitin-activating enzyme，E1)、泛素结合酶(ubiquitin-conjugating enzyme，E2)、泛素-蛋白连接酶(ubiquitin-protein ligase，E3)、26S蛋白酶体及去泛素化酶(deubiquitinatingenzyme，DUB)等组成。泛素化的蛋白被蛋白酶体复合物识别后降解为若干小肽段，可以与MHCⅠ类分子结合被抗原提呈细胞识别，诱导特异性CTL反应。诸多研究表明，将泛素和抗原蛋白连接可显著促进抗原蛋白在细胞内的降解、递呈，增强抗原诱导的免疫应答。
　　 树突状细胞(dendritic cell，DC)是目前发现功能最强的抗原递呈细胞，它通过吞噬、表达、迁移等一系列过程，启动体内的免疫系统。已有研究表明，通过各种途径将DC负载病毒或肿瘤抗原，可促进抗原的加工提呈，有效激活抗原特异性CTL应答。
　　 本研究通过构建强制泛素化乙肝病毒核心抗原(Ub-HBcAg)重组慢病毒，体外转染小鼠骨髓源性DC，观察慢病毒(lentivirus，LV)介导的Ub-HBcAg基因修饰DC体外诱导抗原特异性的细胞免疫反应。本实验共分三部分：(1)Ub-HBcAg基因重组慢病毒(LV-Ub-HBcAg)的构建及其表达；(2)LV-Ub-HBcAg诱导小鼠髓源性树突状细胞成熟及在T淋巴细胞增殖中的作用；(3)LV-Ub-HBcAg修饰DC诱导CTL反应的体外研究。
　　 第一部分Ub-HBcAg基因重组慢病毒的构建及其表达
　　 目的：构建Ub-HBcAg融合基因的慢病毒载体，包装成重组慢病毒并观察目的基因在293T细胞中的表达。
　　 方法：PCR扩增Ub-HBcAg融合基因，插入到慢病毒骨架质粒pWPXLd中，构建成重组质粒pW-Ub-HBcAg。将重组的质粒pW-Ub-HBcAg和慢病毒包装质粒psPAX2、包膜质粒PMD2.G用脂质体共转染293T细胞，获得携带Ub-HBcAg基因的重组慢病毒LV-Ub-HBcAg，并通过Western blot检测目的基因在293T细胞中的表达。
　　 结果：强制泛素化HBcAg融合基因的慢病毒载体经测序证实目的基因序列及插入方向均正确，荧光倒置显微镜观察到转染病毒细胞内绿色荧光蛋白(green fluorescentprotein，GFP)的表达，Western blot检测到目的蛋白在293T细胞中的表达。
　　 结论：成功构建了携带强制泛素化HBcAg融合基因的慢病毒，转染293T细胞后能够稳定表达目的基因。
　　 第二部分LV-Ub-HBcAg诱导小鼠髓源性树突状细胞成熟及在T淋巴细胞增殖中的作用
　　 目的：观察LV-Ub-HBcAg诱导体外培养的小鼠髓源性树突状细胞成熟及对T淋巴细胞增殖的作用。
　　 方法：体外分离培养近交系Balb/c小鼠髓源性DC，加重组小鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony-simulating factor，GM-CSF)，重组白细胞介素(interleukin，IL)-4培养5d，再加入LV-Ub-HBcAg，LV-HBcAg或LV诱导树突状细胞成熟，同时设阳性对照LPS组。流式细胞仪测定DC表面分子表达，ELISA法测定DC培养上清中IL-12的水平，Cell Counting Kit-8(CCK8)试剂盒检测T淋巴细胞增殖反应。两组间均数比较采用t检验。
　　 结果：体外成功诱导培养小鼠髓源性DC，LV-Ub-HBcAg转染DC效率达56.1％，能明显上调DC表面分子CD80、CD86和MHC-Ⅱ类分子表达，能促进DC分泌IL-12(128.08±15.09)pg/ml，且明显高于LV-HBcAg组分泌的量(P<0.01)。LV-Ub-HBcAg诱导DC刺激T细胞增殖能力显著高于LV-HBcAg组。
　　 结论：LV-Ub-HBcAg能有效转染DC，促进DC分化、成熟，上调表面共刺激分子表达，增强DC刺激T细胞增殖及分泌IL-12能力。
　　 第三部分 LV-Ub-HBcAg修饰DC诱导CTL反应的体外研究
　　 目的：探讨慢病毒载体介导的Ub-HBcAg基因修饰DC体外诱导CTL反应。
　　 方法：体外分离培养小鼠髓源性DC，加入重组慢病毒刺激DC成熟并与T淋巴细胞共培养，ELISA检测T淋巴细胞上清中IL-2、IL-4、IL-10和干扰素(interferon，IFN)-γ的分泌水平，流式细胞仪检测胞内细胞因子水平。
　　 结果：LV-Ub-HBcAg刺激的DC能有效促进T淋巴细胞分泌细胞因子，其中IL-2(436.5±44.6 pg/ml)和IFN-γ(144.6±15.6 pg/ml)明显高于LV-HBcAg组中IL-2(367.8±59.4 pg/ml)和IFN-γ(102.1±13.3 pg/ml)分泌。流式细胞仪检测LV-Ub-HBcAg诱导的CTL数量明显高于对照组。
　　 结论：经Ub-HBcAg基因致敏的DC能有效刺激T淋巴细胞分泌Th1型细胞因子及增加CTL的表达。